Indurre l'epilessia post-traumatica in un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche diffuse ripetitive

Summary

Questo protocollo sistematico descrive un nuovo modello animale di epilessia post-traumatica dopo una lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva. La prima parte descrive i passaggi per l’induzione traumatica delle lesioni cerebrali utilizzando un modello di goccia di peso modificato. La seconda parte fornisce istruzioni sull’approccio chirurgico per i sistemi di acquisizione di dati elettroencefalografici a singolo e multicanale.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di epilessia acquisita. TBI può provocare una lesione cerebrale focale o diffusa. Lesione focale è il risultato di forze meccaniche dirette, a volte penetrando attraverso il cranio, creando una lesione diretta nel tessuto cerebrale. Questi sono visibili durante l’imaging cerebrale come aree con con contusione, lacerazione ed emorragia. Le lesioni focali inducono la morte neuronale e la formazione di cicatrici gliali e sono presenti nel 20%-25% di tutte le persone che incorrono in un TBI. Tuttavia, nella maggior parte dei casi di TBI, la lesione è causata da forze di accelerazione-decelerazione e successiva tosatura dei tessuti, con conseguente danno non focale e diffuso. Una sottopopolazione di pazienti affetti da TBI continua a sviluppare l’epilessia post-traumatica (PTE) dopo un periodo di latenza di mesi o anni. Attualmente, è impossibile prevedere quali pazienti svilupperanno PTE e le crisi epilettiche nei pazienti affetti da PTE sono difficili da controllare, rendendo necessaria un’ulteriore ricerca. Fino a poco tempo fa, il campo era limitato a soli due modelli animali/roditori con convulsioni post-traumatiche spontanee convalidate, entrambe con gravi lesioni focali con massiccia perdita di tessuto nella corteccia e talvolta strutture subcorticali. A differenza di questi approcci, è stato determinato che la TBI diffusa indotta utilizzando un modello di caduta di peso modificato è sufficiente per avviare lo sviluppo di crisi convulsive e non convulsive spontanee, anche in assenza di lesioni focali o perdita di tessuto. Simile ai pazienti umani con epilessia post-traumatica acquisita, questo modello presenta un periodo di latenza dopo l’insorgenza del sequestro. In questo protocollo, la comunità sarà dotata di un nuovo modello di epilessia post-traumatica, descrivendo in dettaglio come indurre TBI non lesionale diffusa seguita da un monitoraggio continuo degli animali video-elettroencefalografici a lungo termine nel corso di diversi mesi. Questo protocollo descrive in dettaglio la gestione degli animali, la procedura di caduta del peso, il posizionamento degli elettrodi per due sistemi di acquisizione e le frequenti sfide incontrate durante ciascuna delle fasi dell’intervento chirurgico, del monitoraggio postoperatorio e dell’acquisizione dei dati.

Introduction

Ogni anno TBI colpisce circa 60 milioni di persone in tutto il mondo. Gli individui interessati sono a più alto rischio di sviluppare l’epilessia, che può manifestarsi anni dopo la lesione iniziale. Anche se i TBI gravi sono associati a un rischio più elevato di epilessia, anche la TBI lieve aumenta la probabilità di un individuo di sviluppare l’epilessia^1,2,3^,4. Tutti i TBI possono essere classificati come focali, diffusi o una combinazione di entrambi. Lesione cerebrale diffusa, presente in molti se non in tutti i TBC, è il risultato di tessuti cerebrali di densità diverse tosatura contro l’altro a causa di accelerazione-decelerazione e forze rotazionali. Per definizione, la lesione diffusa si verifica solo in isolamento in lesioni cerebrali miti/concussive non penetranti, in cui nessuna lesione cerebrale è visibile sulle scansioni tomografiche computertiche⁵.

Ci sono attualmente due problemi critici nella gestione dei pazienti che hanno, o sono a rischio di, lo sviluppo di epilessia post-traumatica (PTE). Il primo è che una volta che la PTE si è manifestata, le crisi sono resistenti ai farmaci antiepilettici disponibili (AED)⁶. In secondo luogo, gli ED sono ugualmente inefficaci nella prevenzione dell’epilettia e non esistono approcci terapeutici alternativi efficaci. Per affrontare questo deficit e trovare migliori obiettivi terapeutici e candidati per il trattamento, sarà necessario esplorare nuovi meccanismi cellulari e molecolari alla radice di PTE⁶.

Una delle caratteristiche principali dell’epilessia post-traumatica è il periodo latente tra l’evento traumatico iniziale e l’insorgenza di crisi spontanee, non provocate e ricorrenti. Gli eventi che si verificano all’interno di questa finestra temporale sono un focus naturale per i ricercatori, perché questa finestra temporale potrebbe consentire il trattamento e la prevenzione del PTE del tutto. I modelli animali sono più comunemente utilizzati per questa ricerca perché offrono diversi vantaggi distinti, non ultimo dei quali è che il monitoraggio continuo dei pazienti umani sarebbe sia impraticabile e costoso su tali intervalli di tempo potenzialmente lunghi. Inoltre, i meccanismi cellulari e molecolari alla radice dell’epileptogenesi possono essere esplorati solo in modelli animali.

I modelli animali con convulsioni post-traumatiche spontanee ed epilessia sono preferiti rispetto ai modelli in cui le convulsioni sono indotte dopo la TBI con mezzi meno fisiologici, come ad esempio mediante chemioconvulsivi o stimolazione elettrica acutamente, cronicamente o per accensione. Modelli spontanei di crisi post-traumatica testano come il TBI modifidi la rete cerebrale sana che porta all’epilettia. Gli studi che utilizzano una stimolazione aggiuntiva dopo il TBI valutano come l’esposizione al TBI riduce la soglia di convulsione e influisce sulla suscettibilità alle crisi epilettiche. I vantaggi dei modelli animali con crisi epilettiche indotte chimicamente o con stimolazione elettrica sono nel testare i meccanismi specifici della rifrattanza agli DAE e l’efficacia dei DAE esistenti e nuovi. Tuttavia, il grado di pertinenza e la traduzione di questi dati nell’uomo può essere ambiguo⁷ a causa dei seguenti: 1) i meccanismi di convulsione possono essere diversi da quelli indotti dalla sola TBI; 2) non tutti questi modelli portano a crisi spontanee⁷; 3) le lesioni create dall’agente convulso stesso, con la cannula necessaria per la sua consegna, o stimolando il posizionamento degli elettrodi in strutture di profondità (ad esempio, l’ippocampo o l’amigdala) possono già causare una maggiore suscettibilità organizzativa e persino potenziali di campo epilettico ippocampali⁷. Inoltre, alcuni agenti convulsivi (cioè l’acido kainico) producono lesioni ippocampali dirette e sclerosi, che non è tipica dopo la TBI diffusa.

Fino a poco tempo fa, esistevano solo due modelli animali di epilessia post-traumatica: impatto corticale controllato (CCI, focale) o lesione di percussioni fluide (FPI, focale e diffusa)⁸. Entrambi i modelli provocano grandi lesioni focali a fianco di perdita di tessuto, emorragia, e gliosi in roditori⁸. Questi modelli imitano l’epilessia post-traumatica indotta da grandi lesioni focali. Uno studio recente ha dimostrato che la TBI diffusa ripetuta (3x) è sufficiente per lo sviluppo di convulsioni spontanee ed epilessia nei topi anche in assenza di lesioni focali⁹, aggiungendo un terzo modello PTE di roditori con convulsioni ricorrenti spontanee confermate. Questo nuovo modello imita i cambiamenti cellulari e molecolari indotti dalla TBI diffusa, rappresentando meglio la popolazione umana con TTB lievi e concussive. In questo modello, il periodo latente di tre settimane o più prima dell’insorgenza del sequestro e l’emergere di crisi epilettiche tardive, spontanee e ricorrenti, consentono di studiare le cause profonde dell’epilettia post-traumatica, testando l’efficacia di approcci preventivi e nuovi candidati terapeutici dopo l’insorgenza del sequestro e ha il potenziale per lo sviluppo di biomarcatori di epiptogenesi epilessia post-traumatica perché circa la metà degli animali sviluppa post-epilepposizione.

La scelta del modello animale per lo studio dell’epilessia post-traumatica dipende dalla questione scientifica, dal tipo di lesione cerebrale studiata e dagli strumenti che verranno utilizzati per determinare i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. In definitiva, qualsiasi modello di epilessia post-traumatica deve dimostrare sia l’emergere di crisi epilettiche spontanee dopo la TBI sia un periodo di latenza iniziale in un sottoinsieme di animali TBI, perché non tutti i pazienti che incorrono in un TBI continuano a sviluppare l’epilessia. Per fare questo, l’elettroencefalografia (EEG) con acquisizione video simultanea viene utilizzata in questo protocollo. Comprendere gli aspetti tecnici alla base dell’hardware e degli approcci di acquisizione dei dati è fondamentale per un’interpretazione accurata dei dati. Gli aspetti critici dell’hardware includono il tipo di sistema di registrazione, il tipo di elettrodi (cavio o filo) e il materiale di cui sono fatti, l’acquisizione video sincronizzata (come parte del sistema EEG o di terze parti) e le proprietà del sistema informatico. È imperativo impostare i parametri di acquisizione appropriati in qualsiasi tipo di sistema a seconda dell’obiettivo dello studio, degli eventi EEG di interesse, del metodo di ulteriore analisi e della sostenibilità dell’archiviazione dei dati. Infine, il metodo di configurazione degli elettrodi (montaggio) deve essere considerato, in quanto ognuno presenta vantaggi e svantaggi e influenzerà l’interpretazione dei dati.

Questo protocollo descrive in dettaglio come utilizzare il modello di caduta del peso Di Marmarou modificato^10,11 per indurre lesioni diffuse con conseguente crisi spontanee, non provocate, ricorrenti nei topi, descrive gli approcci chirurgici per acquisire un eEG video a singolo e multicanale e sincronizzato utilizzando montaggio monopolare, bipolare o misto.

Protocol

Tutte le procedure relative a questo protocollo sono state eseguite in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) della Virginia Tech e nel rispetto della “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio” dei National Institutes of Health . 1. Protocollo di movimentazione degli animali NOTA: Questo protocollo ha lo scopo di abituare gli animali ordinati da un venditore alla struttura dopo l’arrivo e di condizione loro di…

Representative Results

Il protocollo qui descritto descrive il metodo per l’induzione di una lesione diffusa in isolamento (ad esempio, in assenza di una lesione focale) utilizzando un modello murino di TBI diffuso ripetitivo (Figura 1). Figura 1 illustra il dispositivo di riduzione di peso e i relativi componenti(Figura 1A, a1- a5) utilizzato per l’induzione di TBI in questo modello e passaggi cruciali durante la procedu…

Discussion

A differenza dei modelli CCI e FPI che inducono sia la lesione focale che quella di una lesione diffusa, il modello di TBI diffuso ripetitivo descritto in questo protocollo consente l’induzione di lesioni diffuse in assenza di lesioni cerebrali focali e non richiede cuoio capelluto o aperture craniche e l’infiammazione associata. Un ulteriore vantaggio dell’assenza di crania in questo modello è che permette non solo di impiantare gli elettrodi per la registrazione eTG continua cronica, ma anche la creazione di una fines…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB