Mikrosatellitdna-genotypebestemmelse og flow cytometri-Ploidy analyser af formalin-fast paraffin-indlejret Hydatidiform Molarvæv
Summary
Hydatidiform modermærker er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier, der kan klassificeres efter deres morfologiske egenskaber og forældrenes bidrag til molære genomer. Her beskrives protokoller for multiplex-DNA-genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret molarvæv i detaljer sammen med resultaterne ‘ tolkning og integration.
Abstract
Hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved overdreven trofoblastiske proliferation og unormal fosterudvikling. Der er to typer af HM baseret på mikroskopisk morfologisk evaluering, komplet HM (CHM) og partiel HM (PHM). Disse kan opdeles yderligere på grundlag af forældrenes bidrag til molære genomer. En sådan karakterisering af HM, af morfologi og genotype analyser, er afgørende for patienthåndtering og for den grundlæggende forståelse af denne spændende patologi. Det er veldokumenteret, at morfologisk analyse af HM er underlagt bred interobserver variabilitet og er ikke tilstrækkelig i sig selv til præcist at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra hydropic ikke-molære aborter. Genotyping analyse udføres for det meste på DNA og væv fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) produkter af undfangelse, som har mindre end optimal kvalitet og kan derfor føre til forkerte konklusioner. I denne artikel gives der detaljerede protokoller for multiplex-genotypebestemmelse og flowcytometri-analyser af FFPE molarvæv sammen med fortolkningen af resultaterne af disse metoder, deres fejlfinding og integrationen med den morfologiske evaluering , P57KIP2 Immunhistokemi og fluorescens in situ-hybridisering (fisk) for at nå frem til en korrekt og robust diagnose. Her, forfatterne deler de metoder og erfaringer i de seneste 10 år fra analysen af ca. 400 produkter af undfangelse.
Introduction
En hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved unormal fosterudvikling, hyperproliferation af trophoblast, og hydropic degeneration af choriongonadotropin villi (CV). Historisk, HM plejede at være opdelt i to typer, komplet HM (CHM) og delvis HM (PHM) baseret kun på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist sig, at morfologisk evaluering alene ikke er tilstrækkelig til at klassificere HM i de to undertyper (chm og PHM) og skelne dem fra ikke-molære aborter2,3,4.
Da CHM og PHM har forskellige tilbøjeligheder til maligniteter, er det derfor vigtigt præcist at bestemme den genotypiske type HM for at give patienterne passende opfølgning og ledelse. Derfor er der i de seneste årtier blevet udviklet og udviklet flere metoder med henblik på at identificere forældrenes bidrag til molarvæv og opnå en korrekt klassificering af HM. Disse omfatter karyotype analyse, kromosom banding polymorfi, humant leukocytantigen (HLA) serologisk indtastning, begrænsning fragment længde polymorfi, varierende antal tandem gentagelser, microsatellite Geno Typing, flow cytometry, og P57 KIP2 immun histokemi. Dette har gjort det muligt nøjagtig underinddeling af HM forestillinger baseret på forældrenes bidrag til deres genomer, som følger: chm, som er diploide androgenetisk mono spermisk eller diploide androgen dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% af tilfældene5,6,7,8. Desuden er der en anden genotypisk type HM, der opstod i de sidste to årtier, som er diploide biparental. Sidstnævnte er for det meste tilbagevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simpleks tilfælde) eller mindst to familiemedlemmer (familiær tilfælde). Disse diploide biforældres modermærker er for det meste forårsaget af recessive mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterne9,10,11,12. Diploid biparental HM hos patienter med recessive mutationer i NLRP7 kan diagnosticeres som chm eller PHM ved morfologisk analyse, og dette synes at være forbundet med sværhedsgraden af mutationer i patienterne13,14. Ud over klassificeringen af HM i henhold til deres genotyper tillod indførelsen og brugen af flere genotypebestemmelse at skelne mellem de forskellige molære enheder fra ikke-molære aborter, såsom aneuploide diploide biforældres forestillinger og andre typer af forestillinger5,15. Sådanne forestillinger kan have nogle trofoblast spredning og unormal villøs morfologi, der efterligner, til en vis grad, nogle morfologiske træk af HM.
Formålet med denne artikel er at tilvejebringe detaljerede protokoller for multiplex genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv, og omfattende analyser af resultaterne af disse metoder og deres integration med andre metoder til korrekt og endegyldig diagnose af molære væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier og har forskellige histologiske og genotypiske typer, hvilket gør deres nøjagtige klassificering og diagnose udfordrende. Histopatologiske morfologiske vurderinger blev ofte påvist unøjagtige og er derfor upålidelige i sig selv til at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra ikke-molære aborter. Derfor kræver en nøjagtig diagnose af HM brug af andre metoder såsom multiplex-DNA-genotypebestemmelse, Ploidi-analyse ved flow cytometri, Ploidi-analys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Sophie patrier og Marianne parésy for at dele den oprindelige flow flowcytometri-protokol og promega og qiagen for forsyninger og reagenser. Dette arbejde blev støttet af Réseau Québécois en reproduktion og det canadiske Institut for sundhedsforskning (MOP-130364) til R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
