Summary
Los lunares hidatidiformes son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas que se pueden clasificar según sus características morfológicas y la contribución parental a los genomas molares. Aquí, los protocolos de genotipado de ADN microsatélite multiplex y citometría de flujo de tejidos molares de parafina incrustados fijados por formalina se describen en detalle, junto con la interpretación e integración de los resultados.
Abstract
El lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por una proliferación trofoblástica excesiva y un desarrollo embrionario anormal. Existen dos tipos de HM basados en la evaluación morfológica microscópica, HM completa (CHM) y HM parcial (PHM). Estos pueden subdividirse aún más en función de la contribución parental a los genomas molares. Tal caracterización de HM, por morfología y análisis de genotipos, es crucial para el manejo del paciente y para la comprensión fundamental de esta patología intrigante. Está bien documentado que el análisis morfológico de HM está sujeto a una amplia variabilidad interobservador y no es suficiente por sí solo para clasificar con precisión hm en CHM y PHM y distinguirlos de abortos hidropicos no molares. El análisis de genotipado se realiza principalmente en EL ADN y los tejidos de los productos de concepción de parafina fijados en formalina (FFPE), que tienen una calidad inferior a la óptima y, por lo tanto, pueden conducir a conclusiones erróneas. En este artículo, se proporcionan protocolos detallados para el genotipado multiplex y análisis de citometría de flujo de los tejidos molares FFPE, junto con la interpretación de los resultados de estos métodos, su solución de problemas y la integración con la evaluación morfológica , inmunohistoquímica p57KIP2 e hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para llegar a un diagnóstico correcto y robusto. Aquí, los autores comparten los métodos y lecciones aprendidas en los últimos 10 años del análisis de aproximadamente 400 productos de concepción.
Introduction
Un lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por un desarrollo embrionario anormal, hiperproliferación del trofototo y degeneración hidrográfica de vellosidades coriónicas (CV). Históricamente, HM solía dividirse en dos tipos, HM completo (CHM) y HM parcial (PHM) basado únicamente en la evaluación morfológica1. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica por sí sola no es suficiente para clasificar HM en los dos subtipos (CHM y PHM) y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares2,3,4.
Debido a que CHM y PHM tienen diferentes propensiones a las neoplasias malignas, por lo tanto, es importante determinar con precisión el tipo genotípico de HM para proporcionar un seguimiento y un manejo adecuados a los pacientes. En consecuencia, en las últimas décadas, se han desarrollado y evolucionado varias metodologías con el fin de identificar la contribución parental a los tejidos molares y alcanzar una clasificación correcta de HM. Estos incluyen análisis de cariotipo, polimorfismo de bandas cromosómicas, tilometría serológica de antígeno leucocito humano (HLA), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem, genotipado de microsatélites, citometría de flujo y p57 Inmunohistoquímica KIP2. Esto ha permitido una subdivisión precisa de las concepciones hm basadas en la contribución de los padres a sus genomas, de la siguiente manera: CHM, que son diploides androgenéticos androgenéticos o diploides dispermicos androgenéticos, y PHM, que son triploide, disperménico en 99% y monobrímico en el 1% de los casos5,6,7,8. Además, hay otro tipo de HM genotípico que surgió en las últimas dos décadas, que es diploide biparental. Este último es en su mayoría recurrente y puede afectar a un solo miembro de la familia (casos simplex) o al menos a dos miembros de la familia (casos familiares). Estos lunares biparentales diploides son causados principalmente por mutaciones recesivas en NLRP7 o KHDC3L en los pacientes9,10,11,12. Diploid biparental HM en pacientes con mutaciones recesivas en NLRP7 puede ser diagnosticado como CHM o PHM por análisis morfológico y esto parece estar asociado con la gravedad de las mutaciones en los pacientes13,14. Además de la clasificación de HM según sus genotipos, la introducción y el uso de varios métodos de genotipado permitieron distinguir las diversas entidades molares de los abortos espontáneos no molares, tales como concepciones biparentales diploides aneuploides y otros tipos de concepciones5,15. Tales concepciones pueden tener alguna proliferación de trofoblastos y morfología villosa anormal que imitan, hasta cierto punto, algunas características morfológicas de HM.
El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el genotipado multiplex y la citometría de flujo de los tejidos de parafina incrustada en formalina-fijación (FFPE), y análisis exhaustivos de los resultados de estos métodos y su integración con otros métodos para diagnóstico correcto y concluyente de los tejidos molares.
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Protocol
Este estudio de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de McGill. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio y para que sus productos FFPE de concepción (POC) se recuperaran de varios departamentos de patología.
NOTA: Si bien existen varios métodos para el genotipado y la determinación de la ploidía por citometría de flujo, los protocolos proporcionados aquí describen un método de análisis utilizando una plataforma para cada uno.
1. Genotipado
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Selección del mejor bloque FFPE
- Para cada producto FFPE de concepción (POC), prepare secciones teñidas de hematoxilina y eosina (H&E) de 4 m de espesor, tal como se describe en las secciones 1.2 y 1.3, una para cada bloque disponible, para la evaluación morfológica por microscopía.
- Usando las diapositivas H&E y un microscopio de luz, seleccione el bloque FFPE que tiene la mayor cantidad de vellosidades coriónicas (CV), y si es posible, el bloque que tiene CV separado de, y no entremezclado con, tejidos maternos.
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Seccionamiento
- Coloque el bloque elegido sobre hielo durante 15 minutos para facilitar el seccionamiento.
- Ajustar el microtomo para cortar secciones de 4 m de espesor para la evaluación morfológica microscópica y de 10 m de espesor para la extracción de ADN.
- Coloque el bloque frío en el microtomo y corte una sección de cada bloque para la tinción de H&E y 10 a 30 secciones del bloque elegido, dependiendo de la cantidad de CV en el bloque, para la extracción de ADN.
NOTA: Para los bloques que están llenos de CV, 10 secciones son suficientes para la extracción de ADN. Si sólo alrededor del 10% del bloque contiene CV mientras que el resto son tejidos maternos, entonces se necesitan de 20 a 30 secciones para asegurar cantidades suficientes de ADN. - Con fórceps, transfiera cada sección a un baño de agua de 45 oC. Recoja la sección del baño de agua con una diapositiva cargada positivamente(Tabla de Materiales)que previamente está etiquetada con el número de identificación de la muestra usando un lápiz.
- Coloque los portaobjetos que contienen las secciones en un horno a 65 oC para permitir que las secciones se adhieran a los portaobjetos. Mantener los portaobjetos para H&E en el horno durante 25 min. Mantener los portaobjetos para la extracción de ADN en el horno durante 20 min.
NOTA: El menor tiempo de incubación hace que los tejidos sean ligeramente menos adherentes a las diapositivas y, en consecuencia, facilita la extracción de los tejidos maternos.
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Tinción de H&E
- Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente (10 min).
- Preparación de reactivos
- Preparar la solución de trabajo de Eosin Y (0,25%) según el Cuadro 1. Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de hematoxilina de trabajo diluyendo la solución de hematoxilina 5x en agua (es decir, mezclar 80 ml de agua con 20 ml de hematoxilina).
NOTA: Envuelva la solución de material de hematoxilina en papel de aluminio para su almacenamiento.
- Prepare los frascos de tinción con los reactivos correctos bajo una campana de humo según la Tabla 2.
- Realice la tinción H&E sumergiendo las diapositivas en los frascos de tinción apropiados durante el período de tiempo correcto de acuerdo con la Tabla 2.
- Montar las secciones de 4 m para el análisis morfológico con medio de montaje y cubrecondo con tapas de vidrio(Tabla de Materiales).
NOTA: No se deben cubrir las secciones de 10 m para el genotipado. - Deje las secciones de 10 m debajo de la campana de humos durante un mínimo de 3 h para que los olores tóxicos de xileno se disipe.
PRECAUCION: Todos los pasos de tinción deben realizarse bajo una campana de humo. Los productos de xileno deben mantenerse bajo el capó en todo momento porque los olores de xileno son tóxicos. Además, el xileno y la hematoxilina deben desecharse en recipientes especiales. Una vez que estos contenedores están llenos, deben ser desechados según lo recomendado por la organización de seguridad del laboratorio.
| Reactivo | Cantidad |
| Solución de stock de Eosin Y (1%) | 250 ml |
| 80% Etanol | 750 mL |
| Acido acético glacial (concentrado) | 5 mL |
Tabla 1: Solución de trabajo Eosin Y (0,25%) Preparación.
| Reactivo utilizado (100 ml por contenedor) | Duración |
| 1) Xileno | 5 min |
| 2) Xileno | 5 min |
| 3) 100% Etanol | 2 min |
| 4) 95% Etanol | 2 min |
| 5) 70% Etanol | 2 min |
| 6) 50% Etanol | 2 min |
| 7) Agua destilada | 5 min |
| 8) Hematoxilina | 4 min |
| 9) Agua destilada | 5 min |
| 10) Eosin | 1 min |
| 11) 95% Etanol | 5 min |
| 12) 100% Etanol | 5 min |
| 13) Xileno | 5 min |
| 14) Xileno | 5 min |
Tabla 2: Reactivos y duraciones para el protocolo de tinción H&E.
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Aislamiento del CV
- Bajo un estereomicroscopio ligero, utilice fórceps y pequeños trozos de toallitas de papel humedecidas por agua(Tabla de materiales)para raspar los tejidos maternos no deseados de secciones de 10 m de espesor teñidas por H&E.
NOTA: El objetivo final es mantener nada más que CV o membranas fetales (cuando estén presentes) en las diapositivas y así eliminar todos los demás tejidos. Este paso puede necesitar mucho tiempo y paciencia, dependiendo del bloque, ya que requiere una atención meticulosa a los detalles. - Pida a una segunda persona que revise dos veces los portaobjetos después de la limpieza para asegurarse de que estén libres de tejidos maternos.
- Tome fotos de las diapositivas limpiadas o documente lo siguiente para ayudar con la interpretación de datos: 1) si el tejido era difícil de limpiar, hemorrágico o muy limpio, 2) el número de secciones utilizadas, y 3) la cantidad aproximada de tejidos limpios.
NOTA: La Figura 1 proporciona un ejemplo de una diapositiva que es fácil de limpiar. Para un bloque que contiene aproximadamente esta cantidad de CV, 10 secciones son suficientes para la extracción de ADN. La diapositiva de la Figura 2 tiene muy pocos CV que se entremezclan con tejidos maternos, lo que hace que sea muy difícil y lento limpiar. Para un bloque que contiene aproximadamente esta cantidad de CV, se necesitan 30 secciones para la extracción de ADN. - Recoja el CV con pequeñas toallitas de papel humedecidas. Usando los fórceps, arranca una pequeña pieza de las toallitas de papel humedecida y úsala para recoger el CV.
- Coloque las toallitas de papel con su CV adjunto en un tubo etiquetado de 1,5 ml.
- Minimice la cantidad de toallitas de papel utilizadas en este paso, ya que demasiado puede obstruir la columna de extracción de ADN y, en consecuencia, reducir la cantidad final de ADN recogido. En promedio, tenga como objetivo utilizar menos de siete pequeños trozos de toallitas de papel por muestra. Si eso no es posible debido a la presencia de grandes cantidades de CV, divida la muestra entre dos tubos para facilitar la extracción.
- Bajo un estereomicroscopio ligero, utilice fórceps y pequeños trozos de toallitas de papel humedecidas por agua(Tabla de materiales)para raspar los tejidos maternos no deseados de secciones de 10 m de espesor teñidas por H&E.
Figura 1: Diapositiva representativa para el genotipado. Arriba: Una diapositiva que necesita ser "limpiada" para liberarse de los tejidos maternos. Parte inferior: La misma diapositiva que se muestra después de que se ha limpiado y ahora no contiene nada más que CV para la extracción de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diapositiva representativa para el genotipado. Arriba: Una diapositiva que necesita ser "limpiada" para liberarse de los tejidos maternos. Parte inferior: La misma diapositiva que se muestra después de que se ha limpiado y ahora no contiene nada más que CV para la extracción de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Siga el protocolo de la extracción de ADN del kit FFPE(Tabla de Materiales)para realizar la extracción de ADN.
NOTA: Algunos kits recomiendan el uso de 15 a 20 l de búfer de elución para la elución final. Por experiencia, la elución con 15 l de tampón de elución funciona bien para la mayoría de las muestras. Las diluciones se pueden preparar a partir del ADN de la acción según sea necesario.
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Cuantificación del ADN
- Usando un dispositivo de espectrofotómetro de laboratorio, cargue 1 l de ADN y mida la absorbancia a 260 nm para la cuantificación.
- Cargue 1 l de ADN en un gel de agarosa del 2% y ejecute la electroforesis de gel a una tensión de 80 a 100 V para una evaluación cualitativa.
- Sobre la base de los resultados de los pasos 1.6.1 y 1.6.2, elija el volumen de ADN que se utilizará en la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de repetición en tándem corto multiplex (STR). Intenta utilizar un mínimo de 1000 ng de ADN en la amplificación de PCR que sigue.
NOTA: La Figura 3 muestra ejemplos representativos de geles junto con las concentraciones del ADN (basados en los resultados del espectrofotómetro), y el volumen de la solución de ADN que se recomienda para el multiplexS STR PCR que sigue.
Figura 3: Gel representativo para la cuantificación del ADN. Se incluyen las concentraciones de cada ADN, medida utilizando un espectrofotómetro, y las cantidades utilizadas para el PCR multiplex. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Amplificación de PCR
- Realizar genotipado de microsatélites fluorescentes utilizando un sistema STR multiplex(Tabla de materiales).
- Utilice las condiciones de PCR que se muestran en la Figura 4 para la amplificación de PCR utilizando el sistema STR multiplex(Tabla de materiales).
NOTA: Los siguientes imprimadores se utilizan en este sistema STR multiplex: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 y D.
Figura 4: Condiciones del ciclo PCR para el sistema STR multiplex. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Resolver los productos PCR por electroforesis capilar.
- Suspenda 1 l de cada muestra amplificada en 0,5 l del carril estándar interno del sistema multiplex y 9,5 ml de formación altamente desionizada(Tabla de materiales).
- Ejecute muestras a través de un instrumento de electroforesis capilar(Tabla de materiales) utilizando una matriz de separación adecuada(Tabla de materiales)para el instrumento y el conjunto de tinte sin sistema multiplex.
- Análisis de datos
- Analice los datos con un software de análisis de fragmentos de ADN y compare los alelos POC con los alelos parentales para determinar su origen.
- Configure un estándar de tamaño.
NOTA: Esto permite que el software reconozca la escalera que se utiliza en el sistema STR multiplex, y asignar pares de bases a los amplicons basados en la escalera. Los siguientes pasos son para un software específico(Tabla de materiales),pero también pueden ser de ayuda para configurar otros tipos de software.- Abra el software. Haga clic en Iniciar nuevo proyecto y luego en Nuevo tamaño estándar.
- Asigne un nombre al estándar de tamaño (por ejemplo, ABI_600).
- En el cuadro llamado Introducir nueva definición estándar:escriba lo siguiente: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. A continuación, haga clic en Añadir tamaño(s).
NOTA: Los números introducidos aparecerán debajo del cuadro de la derecha, que se denomina Definición estándar de tamaño actual (consulte la figura 5). - Haga clic en Guardar.
- Para importar y analizar un archivo, haga clic en Agregar archivosy elija el archivo fsa que desea analizar. Haga clic en Agregar archivos seleccionados y luego en Aceptar. A continuación, siga estos pasos:
- Busque la columna Size Standard y elija ABI_600 (o cualquier nombre que se haya dado al estándar de tamaño).
- En Método de análisis, haga clic en Tamaño predeterminado - NPP y, a continuación, haga clic en el botón verde Analizar.
- El archivo ya está listo para su visualización. Ajuste las opciones de visualización para ver los datos como desee.
- Solución de problemas - método de análisis
NOTA: El software a veces puede fallar para identificar los picos y alinearlos correctamente. Esto sucede cuando los picos son demasiado bajos o demasiado altos. Los dos métodos de análisis siguientes pueden corregirse para esto y deben probarse antes de que se vuelva a probar una muestra.- Método de análisis 1 para picos altos:
- Haga clic en Nuevo método de análisis y asímócelo High Peaks (u otro nombre según sus preferencias personales).
- Haga clic en Rango y luego en Rango parcial para el análisis y el tamaño. A continuación, escriba 100 para el punto inicial y el tamañoinicial .
- Para el punto de parada, escriba 10.000. Para el tamaño de detención, escriba 1000.
- A continuación, haga clic en Alturas máximas mínimas y cambie los números de modo que el umbral máximo para los colores sea el siguiente: Azul: 50; Verde: 50; Amarillo: 20; Rojo: 100; Naranja: 5000.
- Guarde el nuevo método de análisis.
- Método de análisis 2 para picos bajos:
- Haga clic en Nuevo método de análisis y asímócelo Low Peaks (u otro nombre según sus preferencias personales).
- Haga clic en Rango y luego en Rango parcial para el análisis y el tamaño. A continuación, escriba 100 para el punto inicial y el tamañoinicial .
- Para el punto de parada, escriba 10.000. Para el tamaño de detención, escriba 1000.
- A continuación, haga clic en Indicadores de calidad y cambie el rango de paso de tal forma que se lee de 0.5 a 1. Cambie el rango de baja calidad de tal forma que lea de 0.0 a 0.0. Cambie La linealidad de suasto a lo siguiente: de (bp) 100.0 a (bp) 800.0.
- Guarde el nuevo método de análisis.
NOTA: Ahora es posible volver a analizar un archivo eligiendo Low Peaks o High Peaks en Analysis Method y luego haciendo clic en el botón verde Analyze.
- Método de análisis 1 para picos altos:
Figura 5: Captura de pantalla que muestra el Editor estándar de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Citometría de flujo
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Elegir el bloque FFPE ideal
- Usando diapositivas H&E y un microscopio de luz, seleccione un bloque FFPE que tenga alrededor del 50-70% de sus tejidos compuestos de CV.
NOTA: La Figura 6 es un ejemplo representativo de un bloque apropiado para el análisis de citometría de flujo, ya que se compone de aproximadamente 50% CV (mitad derecha de la sección) y 50% de tejidos maternos (mitad izquierda). La presencia de tejidos maternos es importante porque sirven como control interno para el pico diploide. - Para bloques que no tienen la cantidad ideal de CV, enriquecer para CV a medida que se realiza el seccionamiento. Para ello, identifique qué lado de las secciones recién cortadas contiene más CV de acuerdo con su diapositiva H&E correspondiente. Sobre la base de eso, utilice una cuchilla para cortar la otra mitad que necesita ser desechada para enriquecer para el CV.
NOTA: La Figura 7 muestra un bloque que no tiene suficiente CV para el análisis de citometría de flujo. Para bloques como éste, las secciones deben ser cortadas de tal manera que la mitad que contiene menos CV se desecha con el fin de aumentar las cantidades de CV con respecto a los tejidos maternos, como se muestra en la figura. Asegúrese de cortar más secciones para compensar lo que se descarta.
- Usando diapositivas H&E y un microscopio de luz, seleccione un bloque FFPE que tenga alrededor del 50-70% de sus tejidos compuestos de CV.
Figura 6: Sección H&E que representa un bloque POC que es ideal para la citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Sección H&E que representa un bloque más difícil para la citometría de flujo. Esta sección representativa de H&E muestra que sólo la mitad inferior de esta sección debe utilizarse para el análisis de citometría de flujo, con el objetivo de enriquecer el CV. El área esbozada, etiquetada como "CV", se compone principalmente de CV. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Seccionamiento
- Deje los bloques sobre hielo durante 15 minutos para facilitar el seccionamiento.
- Usando el mejor bloque FFPE posible, corte cuatro secciones que sean de 50 m de espesor (o dos secciones de 100 m de espesor) usando un microtome.
NOTA: Para la citometría de flujo es preferible tener secciones más gruesas. - En el caso de que no se disponga de un bloque FFPE ideal, tenga como objetivo mantener la relación de CV con el tejido materno. Por ejemplo, si sólo el 30% del bloque está compuesto por CV mientras el resto tiene tejidos maternos, retire al menos la mitad de la sección que contiene los tejidos maternos y use más secciones para compensar (ver Figura 7).
- Coloque las secciones en tubos etiquetados de 15 ml.
NOTA: Asegúrese de pegar sobre las etiquetas porque los reactivos orgánicos utilizados en el siguiente paso pueden disolverse y eliminar la tinta.
- Protocolo de citometría de flujo de los tejidos FFPE
- Desparafinación y rehidratación
- Realice los siguientes lavados (Tabla 3) bajo una campana de humos.
- Llene el tubo de 15 ml con 6 ml del reactivo apropiado, siguiendo el orden presentado en la Tabla 3, deje las secciones en los reactivos durante la duración respectiva y, a continuación, retire el reactivo con aspiración al vacío y una pipeta Pasteur de vidrio.
- Entre cada paso, sumerja la pipeta Pasteur primero en 70% de etanol, luego en agua destilada, y luego proceda al siguiente paso.
- Tenga mucho cuidado de no extraer trozos de tejido junto con el reactivo. Incline el tubo de 15 ml a un ángulo de 60 grados para facilitar la succión del reactivo líquido sin dibujar tejidos.
PRECAUCION: Los líquidos desechados contienen xileno y deben eliminarse en recipientes de residuos de xileno.
- Preparación de la solución
- Preparar la solución de citrato disolviendo 2 g de ácido cítrico en 1 L de agua destilada doble. Lleve el pH a 6. Conservar a 4oC.
- Preparar la solución de pepsina disolviendo 0,01 g de pepsina en 2 ml de 9 partes por mil NaCl, pH 1,64. Esto es para una muestra.
PRECAUCION: La pepsina es tóxica y puede dispersarse fácilmente y en el aire. Use una máscara cuando manipule la pepsina en su forma de polvo y limpie toda el área de trabajo después de usarla. - Propidium Iodida (PI)-ribonucleano Preparación de la solución para una muestra.
- Mezclar 50 s l de PI con 450 s de PBS (para diluir 10x).
- Añadir 50 ml de ribonucleasa A (1 mg/ml) a la mezcla. Mantener envuelto en papel de aluminio en todo momento.
- Digestión y tinción
- Añadir la solución de citrato de 4 oC a los tubos de 15 ml y luego colocar en un baño de agua de 80 oC durante 2 horas.
- Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente (15 min). Retire la solución de citrato.
- Agregue 6 mL de 1x PBS, vórtice, y espere 1 x 2 min para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior. Retire el 1x PBS con succión al vacío y una pipeta Pasteur de vidrio.
- Añadir 1 ml de solución de pepsina (precalentada a 37oC) y colocar en un baño seco de 37oC durante 30 min. Vortex cada 10 min. Preparar la solución PI-ribonuclea Una solución en los últimos 10 min de esta incubación.
- Agregue 6 mL de 1x PBS, vórtice, y espere 1 x 2 min para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior. Retire el 1x PBS con succión al vacío y una pipeta Pasteur de vidrio.
- Añadir 550 l de la solución PI-ribonuclease A y colocar las muestras en un baño seco de 37 oC durante 30 minutos.
NOTA: En este punto, las muestras se pueden envolver en papel de aluminio y dejar durante la noche a 4 oC hasta la mañana siguiente. - Filtre la solución a través de una malla de filtración de 48 m. Recoger el filtrado en tubos de fondo redondo de poliestireno, que se puede utilizar con el catómetro de flujo. Utilice fórceps para colocar una pieza de 5 cm por 5 cm de malla de filtración en la parte superior del tubo, de forma que el líquido se pueda canalizar a través de la malla y en el tubo.
NOTA: Las muestras ya están listas para ejecutarse con el catómetro de flujo. Manténgalos envueltos en papel de aluminio hasta que estén listos para ser ejecutados.
- Ejecute muestras con un catómetro de flujo con la ayuda del técnico de plataforma de citometría de flujo de la organización.
NOTA: El canal PE se utiliza para detectar el ADN manchado de PI y el caudal debe establecerse en Lento durante la adquisición. Asegúrese de que la tensión se elige de tal manera que el pico diploide está aproximadamente en 200 a lo largo del eje X PE-A para facilitar el análisis y la interpretación. Intenta registrar un mínimo de 20.000 eventos por muestra.
- Desparafinación y rehidratación
| Reactivo utilizado (6 ml cada uno) | Duración |
| 1) Xileno | 2 x 10 min |
| 2) 100% Etanol | 2 x 10 min |
| 3) 95% Etanol | 10 min |
| 4) 70% Etanol | 10 min |
| 5) 50% Etanol | 10 min |
| 6) Agua destilada | 2 x 10 min |
Tabla 3: Reactivos y duraciones para la desparafinación y rehidratación.
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Análisis de datos de citometría de flujo
- Analizar datos con un software de análisis de citometría de flujo(Tabla de materiales).
NOTA: Los siguientes pasos son para un software específico(Tabla de materiales),pero también pueden ser de ayuda para configurar otros tipos de software.- Después de ejecutar las muestras en un citometro de flujo, descargue los archivos FCS 2.0 para su análisis.
- Abra el software de análisis de citometría de flujo, haga clic en Archivo . Nuevo documento.
- Haga clic en el
icono Histograma ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear un rectángulo. - Busque el archivo FCS y haga clic en Abrir. A lo largo del eje X, haga clic en FCS-A y, a continuación, seleccione PE-A.
- Haga clic en el
icono Gráfica de puntos ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear otro rectángulo debajo del trazado del histograma. A continuación, busque el mismo archivo FCS seleccionado para el histograma. - Cambie el eje x de la gráfica de puntos a PE-A y el eje Y a PE-W.
NOTA: La Figura 8A muestra la apariencia de las gráficas en este punto. - Haga clic en el
icono Región ( ) y dibuje un cuadro en la gráfica de puntos que comienza antes del pico diploide (alrededor de 100 en el eje X en la Figura 8B)y que termina alrededor de 700 en el eje X, como se muestra en la gráfica de puntos en la Figura 8 B.
NOTA: El pico diploide en la Figura 8 es aproximadamente en 200 en el eje X. Esto se elige arbitrariamente ya que las muestras se registran a través del citómetro de flujo, simplemente para facilitar el análisis y la interpretación de los resultados. - Haga clic en Trazar Edite Regiones/Puertasy, a continuación, escriba R0 en la celda situada junto a la celda G0 en Estrategia. A continuación, haga clic en Cerrar.
- Haga clic en cualquier parte del histograma y, a continuación, en Gráfica de la zona de la zona de la zona de la zona de la zona de la Formato trazado/superposición. En Puerta, seleccione G0 á R0 y, a continuación, haga clic en Aceptar.
NOTA: Este es el paso de gating que permite visualizar mejor los picos de ploidy. El histograma ahora debería parecerse al histograma de la Figura 8B. Es posible jugar con la puerta creada (moviendo el cuadro dibujado en el paso 2.4.1.7) con el fin de centrarse en regiones específicas de la gráfica de puntos. - Para etiquetar los trazados, haga clic
en el icono de área de texto ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear un cuadro en la parte superior del documento y, a continuación, escriba la siguiente información: ID de paciente, ID de POC y el bloque utilizado (ya que puede haber varios bloques para un POC) , porcentaje CV presente en el bloque, voltaje utilizado para ejecutar la muestra y la fecha.
- Analizar datos con un software de análisis de citometría de flujo(Tabla de materiales).
icono Histograma ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear un rectángulo.
icono Gráfica de puntos ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear otro rectángulo debajo del trazado del histograma. A continuación, busque el mismo archivo FCS seleccionado para el histograma.
icono Región ( ) y dibuje un cuadro en la gráfica de puntos que comienza antes del pico diploide (alrededor de 100 en el eje X en la Figura 8B)y que termina alrededor de 700 en el eje X, como se muestra en la gráfica de puntos en la Figura 8 B.
en el icono de área de texto ( ) y, a continuación, arrastre el puntero para crear un cuadro en la parte superior del documento y, a continuación, escriba la siguiente información: ID de paciente, ID de POC y el bloque utilizado (ya que puede haber varios bloques para un POC) , porcentaje CV presente en el bloque, voltaje utilizado para ejecutar la muestra y la fecha.
Figura 8: Captura de pantalla que muestra un histograma y una gráfica de puntos de una muestra representativa que está desencerrada (A) y cerrada (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
La complejidad de los tejidos molares y el hecho de que puedan tener varios genotipos requieren un análisis riguroso y el uso de varios métodos como la evaluación morfológica, la inmunohistoquímica p57, el genotipado de microsatélites, la citometría de flujo y el FISH. Por ejemplo, un paciente (1790) fue referido con dos PHM que se encontró triploide por el análisis de microarray de los POC solamente. Por lo tanto, el paciente fue diagnosticado con PHM recurrente. El genotipado microsatélite de sus dos "PHM" junto con el ADN de la paciente y su pareja reveló que mientras que el primer lunar de la paciente es disperma triploide(Figura 9A),su segundo "PHM" tiene un genotipo dicínico triploide(Figura 9 B) y por lo tanto no es un PHM, sino un aborto espontáneo no molar.
El primer marcador de la Figura 9A (en negro) muestra dos picos en el POC. El primer pico se origina de la madre, ya que sólo la madre tiene un pico de este tamaño. Siguiendo el mismo razonamiento, el segundo pico se origina en el padre ya que comparte el mismo alelo. Observe cómo el segundo pico es mucho más alto que el primero, lo que indica que probablemente hay dos dosis del mismo alelo paterno en ese pico. La contaminación materna, que se explicará con más detalle más adelante, es muy mínima en este POC porque el POC muestra un pico muy pequeño en la posición del segundo alelo materno.
El segundo marcador de la Figura 9A (en azul) muestra tres picos en el POC. Dos de estos picos provienen del padre y uno de la madre. Por lo tanto, de nuevo se desprende de este marcador que hay tres alelos presentes en el POC, dos del padre y uno de la madre. Los marcadores tercero y cuarto de la Figura 9A son similares al primer marcador, y también muestran dos alelos procedentes del padre y uno de la madre.
Dado que los cuatro marcadores muestran consistentemente tres alelos (por dosis o por la presencia de tres alelos de diferentes tamaños), dos originarios del padre y uno de la madre, se puede concluir que este POC es dispermhídrico triploide, y confirma el diagnóstico de PHM.
Los cuatro marcadores de la Figura 9B muestran de nuevo tres alelos: el primer marcador muestra dos dosis en el primer pico que se originan en la madre y una dosis en el segundo pico que se origina en el padre. El segundo y el cuarto marcadores muestran tres picos diferentes (es decir, tres alelos diferentes), dos de los cuales son de la madre. El tercer marcador muestra una dosis en el primer pico procedente del padre y dos dosis en el segundo pico procedente de la madre. Por lo tanto, este POC es de origen digiónico triploide ya que dos conjuntos de cromosomas provienen de la madre y un conjunto proviene del padre. Por lo tanto, es un aborto espontáneo no molar.
Figura 9: Resultados representativos de genotipado del paciente 1790. (A) Seleccione los resultados de genotipado de la primera concepción del paciente que muestran un genotipo dispermítico triploide. (B) Seleccione los resultados del genotipado de la segunda concepción del paciente que muestran un genotipo dignitínico triploide. El eje x está en pares de bases; las etiquetas y los tamaños de par de bases se han omitido por simplicidad. El eje Y representa la altura máxima y se omite de forma similar de la figura para simplificar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta paciente fue inicialmente diagnosticada erróneamente con dos PHM y estaba preocupada por un mayor riesgo de más lunares mientras tenía un solo PHM. Este caso destaca la limitación del microarray SNP solo en el POC. El microarray SNP es un método potente y es el mejor para detectar aneuploides de cualquier cromosoma (trisomias, monosomias o genotipos no diploides); sin embargo, cuando se realiza solo en el POC sin analizar el ADN parental, no se puede determinar el origen de la triploidía. Para obtener más explicaciones sobre el análisis y la interpretación del genotipo, consulte el estudio de Murphy et al.16.
Los resultados representativos mostrados en la Figura 10A son de una concepción triploide. Los valores del eje X representan el contenido de ADN nuclear. Por ejemplo, 200 es un número arbitrario dado a las células que contienen una cierta cantidad de contenido de ADN nuclear. Por lo tanto, un pico de 400 representa células que contienen el doble de contenido de ADN nuclear en comparación con el pico de 200. El pequeño pico alrededor de 300 representa el contenido de ADN nuclear que se encuentra entre el pico 200 y 400 y, por lo tanto, es el pico triploide. Observe cómo una concepción diploide(Figura 10B) no contiene ningún pico en el valor 300.
En algunos casos, el pico triploide es muy sutil(Figura 10C). Siempre que se observe un pico triploide apenas perceptible, es importante considerar primero la cantidad de CV que estaban presentes en las secciones utilizadas para el análisis de citometría de flujo. Si las secciones tenían menos del 20% de CV, entonces probablemente será un verdadero triploidy ya que se espera que sea un pico muy bajo. Si las secciones tomadas tenían altas cantidades de CV, el POC se vuelve sospechoso de mosaico con la presencia de otra población celular diploide. Esto se puede comprobar repasando los resultados del genotipado para ver si se ajustan a una dispermia triploide perfecta o también puede ser confirmado por FISH con sondas de los cromosomas X, Y y 18. Además, utilizando el software descrito en este artículo, es posible establecer puertas específicas, como se describe en la sección 2.4.1, que permiten al usuario centrarse en una región específica para enriquecer para las celdas triploide si realmente existen.
Figura 10: Resultados representativos de la citometría de flujo que demuestran concepciones triploides en (A) y (C), y una concepción diploide en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los HM son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas y tienen diferentes tipos histológicos y genotípicos, lo que hace que su clasificación y diagnóstico precisos sean desafiantes. La evaluación morfológica histopatológica a menudo se demostró inexacta y, por lo tanto, no es fiable por sí sola para clasificar a HM en CHM y PHM y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares. Por lo tanto, un diagnóstico preciso de HM requiere el uso de otros métodos como el genotipado de ADN multix microsatélite, el análisis de loimides por citometría de flujo, el análisis de ploidía por FISH e inmunohistoquímica p57KIP2. Cada uno de estos métodos tiene sus propias limitaciones y ventajas.
Limitaciones y ventajas del genotipado multiplex y la citometría de flujo
La contaminación materna es uno de los problemas más comunes cuando se trabaja con tejidos FFPE y puede conducir a un diagnóstico erróneo, lo que pone de relieve la importancia de separar la madre de los tejidos DE POC. Es importante identificar la contaminación materna para tener una idea de qué esperar de los picos de genotipado y ayudar con su interpretación. Si el nivel de contaminación es demasiado grande y impide una interpretación fiable de los resultados, repita el aislamiento y la extracción del ADN, teniendo especial cuidado en la eliminación de todos los tejidos maternos posibles. En las regiones donde la morfología de los tejidos no está clara, es mejor eliminar dichas regiones para minimizar la posibilidad de contaminación materna. La primera ventaja del método descrito en este protocolo, además de su menor costo, es que los tejidos maternos se retiran de las diapositivas, mientras que otros métodos consisten en recoger los tejidos POC (cubriéndolos con solución que polimeriza cuando se expone al aire y levantar los tejidos) sin extraer los tejidos maternos. El método descrito aquí permite así echar un segundo vistazo a los tejidos POC restantes, volver a limpiarlos si es necesario, como suele ser el caso, y luego recoger y extraer ADN de ellos. La segunda ventaja es que limpiamos los tejidos en secciones manchadas de H&E, lo que facilita en gran medida la eliminación de los tejidos maternos, a diferencia del uso de secciones no manchadas y una diapositiva de mapa tapizado. Sin embargo, la tinción adicional puede degradar aún más el ADN, y esto se compensa mediante la adición de más secciones.
La disponibilidad de ADN parental para el análisis es otro desafío. La presencia de ambos padres facilita en gran medida el análisis y la interpretación de los resultados del genotipado. Desafortunadamente, sin embargo, es muy a menudo el caso de que el ADN del padre no está disponible, lo que a veces puede complicar el análisis, especialmente en los casos en que la calidad del ADN POC es pobre debido a la fijación previa o almacenamiento a largo plazo (más frecuente cuando se trabaja con HM recurrente). Además, es posible que la sangre materna no siempre esté disponible para la extracción de ADN. En tales casos, el ADN materno se puede extraer de los tejidos endometriales maternos presentes en los bloques FFPE como se describió anteriormente16. Además, caracterizar los tejidos molares resultantes del uso de tecnologías de reproducción asistida puede complicar el análisis del genotipo de microsatélite porque, en la mayoría de los casos, el ADN de los donantes (hombres o hembras) generalmente no está disponible.
Por último, el hecho de que los picos más grandes tienden a ser más cortos en términos de altura máxima es otra posible fuente de confusión, especialmente cuando las alturas máximas necesitan ser utilizados para determinar si hay dos dosis o una dosis en un solo pico. Una manera de superar esto es siempre tener en cuenta que los picos de gran tamaño de aleelo (número de pares de base) tienden a ser más cortos, debido a la naturaleza degradada del ADN de los tejidos FFPE, lo que hace que haya menos ADN disponible para la amplificación de alelos más grandes. Además, una amplificación de fragmento de PCR más corta toma menos tiempo que uno más grande, y la amplificación exponencial del ADN conduce a menos cantidades de alelos más grandes.
El principal inconveniente de la citometría de flujo es que las concepciones triploidea a veces pueden perderse, y esto podría ser debido a cantidades insuficientes de CV en el bloque. Sin embargo, la presencia de un pico triploide es una indicación concluyente de un triploide. Tenga en cuenta que este método no es lo suficientemente sensible como para detectar trisomias, concepciones tetraploides u otras aneuploides utilizando este protocolo. Las concepciones tetraploides no son detectables por este protocolo porque el pico tetraploide corresponde al mismo pico de células diploides en la fase G2 del ciclo celular.
Conocer estas limitaciones y desafíos ayuda a reducir los errores. Por lo tanto, es importante y a veces necesario analizar el mismo tejido con diferentes métodos, comparar los resultados y asegurarse de que están en concordancia entre sí. Si no lo están, los resultados deben reconsiderarse y los análisis deben repetirse. Para los varios casos que mostraron resultados contradictorios, las discrepancias se resolvieron simplemente repitiendo los experimentos y teniendo el cuidado adecuado para evitar el problema original. En otros casos, las discrepancias se resolvieron mediante la realización de métodos adicionales como FISH en secciones de tejido o mediante la realización de genotipado simplex adicional con marcadores apropiados.
Identificación de la contaminación materna
Con respecto a la identificación de la contaminación del ADN POC con ADN materno, el nivel de contaminación se reflejará o reconocerá por la presencia de todos los alelos maternos en todos los loci del POC, además de los alelos maternos que se transmiten al POC.
En la Figura 11A,los picos procedentes de la contaminación por ADN materno se etiquetan con una "c". Observe cómo cada pico marcado con una "c" también está presente en la madre, y vemos estos picos "c" en los tres marcadores. Tenga en cuenta que para el segundo marcador (en azul), el pico de contaminación materna indicado por una "c" es mayor que cada pico "c" en el primer marcador porque la madre es homocigota para el segundo marcador; por lo tanto, la altura del contaminante se duplica para este marcador. En este POC, no hay picos de origen materno. En otras palabras, este POC no heredó ningún alelos de la madre. Sólo hay un pico real en cada marcador y este pico no está presente en la madre. Por lo tanto, sabemos que los verdaderos picos deben haber venido del padre. Con información ploidy de cariotipo o análisis de citometría de flujo que demuestra diploide, es posible concluir que este POC es tanto androgenético en origen como en diploide.
Además, estos tres marcadores en la Figura 11A revelan que siempre hay sólo un pico real para cada marcador. Sólo tres marcadores se ilustran aquí, sin embargo, los kits multiplex a menudo vienen con muchos más marcadores que también revelarán el mismo patrón. Puesto que este POC es diploide, debe haber dos dosis en cada pico. Con esta información, podemos concluir que este POC es monodiagnóstico androgenético y es homocigoto en cada marcador.
La Figura 11B representa un POC biparental diploide. La pequeña barra negra a través del primer pico del primer marcador (en verde) representa la cantidad estimada de contaminación que está presente dentro de este pico real. La "R" indica la porción real de este pico que proviene del ADN POC; la "c" representa la porción contaminante de este pico que proviene del ADN materno. ¿Cómo se puede identificar el nivel de contaminación? Es posible, en este caso, cuando un marcador es heterocigoto en la madre porque uno de los alelos maternos está ausente en el POC. El pequeño pico en el primer marcador etiquetado con "c", por ejemplo, indica que este es el nivel de contaminación que debe esperarse para el otro pico hereditario materno. En consecuencia, todos los picos de POC de origen materno son ligeramente superiores a los picos heredados paternalmente debido a la pequeña cantidad añadida de contaminación. Para el tercer marcador (en negro) en la Figura 11B, se espera que el nivel de contaminación sea el doble de la cantidad habitual (porque la madre es homocigota para este marcador específico), y por lo tanto se puede inferir que sólo hay una dosis en el primer pico en el POC.
La Figura 11C ilustra un POC dispermético triploide. El primer marcador (en verde) muestra tres picos en el POC. Puesto que estos tres picos tienen alturas similares, es posible concluir que este POC es probablemente triploide. Tenga en cuenta que el tercer pico de este marcador es más corto que el primero. Esto se espera porque, como tendencia general, los picos más grandes tienden a ser más cortos. El segundo pico es ligeramente superior al primero, y esto puede ser contabilizado por una pequeña cantidad de contaminación materna, como lo indica la barra y "c". Además, dos de estos tres picos no están presentes en la madre, y por lo tanto deben haber venido del padre. Hasta ahora, este marcador indica que el POC podría ser triploide (o una trisomía) y que el origen del conjunto adicional de cromosomas es paterno. También indica que es una concepción dispermética, ya que el POC heredó dos alelos diferentes del padre.
El segundo marcador (en azul) de la Figura 11C tiene solo dos picos. Después de tener en cuenta el nivel de contaminación, el segundo pico parece más alto que el primero, y esto es a pesar de la tendencia general de que los picos más grandes sean más pequeños (una tendencia que siempre debe tenerse en cuenta durante el análisis). Por lo tanto, es probable que haya dos dosis en ese gran pico. Esto también se apoya en el hecho de que el primer marcador es indicativo de triploidy.
Por último, el tercer marcador (en negro) de la Figura 11C muestra tres picos, de nuevo indicativos de triploidía. Dado que la mayoría de los marcadores en kits multiplex provienen de diferentes cromosomas, es posible concluir con confianza que un POC es triploide después de observar la misma tendencia de tres alelos a través de varios marcadores diferentes. También tenga en cuenta de este marcador que dos de los tres picos se originan en el padre, confirmando el origen dispermético.
Figura 11: Resultados de genotipado que ilustran el efecto de la contaminación materna. Los paneles superiores muestran los alelos que pertenecen al POC y los paneles inferiores muestran los que pertenecen a la madre. En (A), el POC es monodiagnóstico androgenético y el nivel de contaminación se resalta con una flecha y la letra "c." En (B), el POC es diploide biparental, y el nivel de contaminación se resalta con la letra "c." En (C), el POC es dispermético triploide y el nivel de contaminación se resalta con la letra "c." Las pequeñas barras negras muestran la cantidad de las alturas máximas que provienen de la contaminación materna y, por lo tanto, deben tenerse en cuenta al comparar las alturas máximas. El eje x está en pares de bases; las etiquetas y los tamaños de par de bases se han omitido por simplicidad. El eje Y representa la altura máxima y se omite de forma similar de la figura para simplificar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ejemplos de casos difíciles
Para una serie de casos, sólo fue posible llegar a una conclusión teniendo las tres evaluaciones simultáneamente (es decir, flujo, p57KIP2y genotipado multiplex). Por ejemplo, un caso (808) se refería como un aborto espontáneo no molar. La evaluación histopatológica conduce a la sospecha de una concepción molar y análisis de genotipado del POC reveló un marcador que mostró claramente tres picos (dos del padre y uno de la madre). Los resultados de p57KIP2 no fueron concluyentes. El análisis de citometría de flujo reveló un pequeño pico triploide que se confirmó con el análisis FISH, que también descartó la presencia de otra población celular diploide. Con la confirmación de FISH, fue posible concluir que el POC es de hecho un lunar dispermético triploide.
Otro caso (1192) también se refirió como aborto espontáneo no molar. El CV de este POC se entremezclaba con tejidos maternos y también eran altamente necróticos, lo que hacía que el proceso de limpieza fuera muy difícil. En consecuencia, el primer análisis de genotipado mostró un alto nivel de contaminación materna, de modo que cada alelo materno podía verse en el POC (una buena indicación de posible contaminación). Además, el p57KIP2 fue por desgracia no concluyente, probablemente debido a la naturaleza necrótica del tejido, tal vez debido a la fijación retardada. Los resultados de la citometría de flujo, sin embargo, fueron indicativos de triploidía, lo que también fue confirmado por FISH. El ADN fue re-extraído con el objetivo de reducir el nivel de contaminación y eliminar tejidos con morfología poco clara. El análisis de los nuevos resultados de genotipado, al tiempo que se tuvo en cuenta la probable presencia de contaminación materna, nos permitió concluir que el POC era un XXY XXY dispermic triploide.
En la Tabla 4 se describen los métodos típicos utilizados para el análisis. Se recomienda utilizar la evaluación morfológica y la inmunohistoquímica p57KIP2 en todos los tejidos sospechosos de HM y al menos un método de genotipado. Entre los métodos de genotipado, el más informativo es el genotipado de ADN multiplex. Cuando los resultados entre diferentes métodos no son concordantes o cuando algunos resultados no son concluyentes, es necesario utilizar otros métodos de genotipado. La tabla muestra los resultados concordantes esperados para cada posible tipo de HM junto con raras excepciones y recomendaciones para resolverlos.
Tabla 4: Orden típico de análisis, resultados esperados y excepciones raras junto con recomendaciones para resolverlos. La inmunohistoquímica P57KIP2 tiene como objetivo detectar la expresión de p57KIP2,la proteína codificada por el gen CDKN1C. Este gen se imprime paternamente en el citotrofolas torácico y el estroma velloso de la placenta del primer trimestre y se expresa sólo desde el genoma materno. Por lo tanto, se utiliza como un marcador auxiliar para detectar, de una manera fácil y económica, la presencia del genoma materno en el POC. Se recomienda realizar la inmunohistoquímica p57KIP2 para todos los POC que se sospeche que son HM en paralelo a la evaluación morfológica. En el laboratorio del autor, se utilizan el anticuerpo p57KIP2 y las plataformas indicadas en la Tabla de Materiales y los autores están muy contentos con la calidad de los resultados. Abreviaturas: IHC - inmunohistoquímica; Dip Y - androgenética diploide; Dip Bip - diploid biparental; Chr - cromosoma; MC - aborto espontáneo; y la proliferación trofoblástica de TP.
Hasta el mejor conocimiento de los autores, este artículo es el primero en proporcionar protocolos detallados para la citometría de flujo, así como genotipado de ADN multix microsatélite de bajo costo y alta calidad de los tejidos FFPE POC. También se describe la interpretación de los resultados, junto con su solución de problemas e integración con los de otros métodos para llegar a conclusiones y diagnósticos precisos de los POC y HM. Los autores esperan sinceramente que este artículo puede ser útil para los investigadores que tratan de entender esta entidad compleja.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Sophie Patrier y Marianne Parésy por compartir el protocolo original de citometría de flujo, y Promega y Qiagen por proporcionar suministros y reactivos. Este trabajo fue apoyado por el Réseau Québécois en Reproduction y el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (MOP-130364) a R.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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