Microsatellite DNA genotipagem e fluxo citometria de análise Ploidy de formalina-fixa parafina-Embedded Hydatidiform molar tecidos
Summary
As toupeiras Hydatidiform são gravidezes humanas anormais com etiologias heterogêneas que podem ser classificadas de acordo com suas características morfológicas e contribuição parental aos genomas do molar. Aqui, os protocolos de genotipagem multiplex do ADN do microssatélites e de fluxo citometria de tecidos parafina-encaixados formalin-fixados do molar são descritos em detalhe, junto com a interpretação e a integração dos resultados.
Abstract
A toupeira Hydatidiform (HM) é uma gravidez humana anormal caracterizada pela proliferação trophoblastic excessiva e pelo desenvolvimento embrionário anormal. Existem dois tipos de HM com base na avaliação morfológica microscópica, HM completo (CHM) e HM parcial (PHM). Estes podem ser mais subdivididos com base na contribuição parental para os genomas molar. Essa caracterização da HM, por meio de análises morfológicas e genotípicas, é crucial para a gestão do paciente e para o entendimento fundamental dessa intrigante patologia. É poço-documentado que a análise morfológica do HM está sujeita à variabilidade interobservador larga e não é suficiente no seus próprios para classificar exatamente HM no chm e no PHM e distingui-los dos Abortions hidrópica do não-molar. A análise de Genotyping é executada na maior parte no ADN e nos tecidos dos produtos parafina-encaixados formalin-fixos (FFPE) da concepção, que têm menos do que a qualidade óptima e podem conseqüentemente conduzir às conclusões erradas. Neste artigo, são fornecidos protocolos detalhados para a análise de genotipagem multiplex e citometria de fluxo de tecidos molar de FFPE, juntamente com a interpretação dos resultados desses métodos, sua solução de problemas e a integração com a avaliação morfológica , P57KIP2 Immunohistochemistry, e a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para alcangar um diagnóstico correto e robusto. Aqui, os autores compartilham os métodos e lições aprendidas nos últimos 10 anos a partir da análise de aproximadamente 400 produtos de concepção.
Introduction
Uma toupeira Hydatidiform (HM) é uma gravidez humana anormal caracterizada pelo desenvolvimento embrionário anormal, pela hiperproliferação do trophoblast, e pela degeneração hidrópica de Villi coriónico (CV). Historicamente, HM costumava ser dividido em dois tipos, HM completo (CHM) e HM parcial (PHM) com base apenas na avaliação morfológica1. No entanto, tem sido demonstrado que a avaliação morfológica isoladamente não é suficiente para classificar HM nos dois subtipos (chm e PHM) e distingui-los de abortos não-molar2,3,4.
Porque o chm e o PHM têm propensões diferentes às malignidades, é conseqüentemente importante determinar exatamente o tipo genotípica de HM para fornecer a continuação e a gerência apropriadas aos pacientes. Conseqüentemente, nas últimas décadas, diversas metodologias têm sido desenvolvidas e evoluídas com o objetivo de identificar a contribuição parental para os tecidos molares e alcançar uma correta classificação da HM. Estes incluem a análise do karyotype, o polimorfismo da borda cromossomática, a tipagem sorológicos do antígeno humano da leucócito (HLA), o polimorfismo do comprimento do fragmento da limitação, número variável de repetições em tandem, genotyping do microssatélites, citometria do fluxo, e P57 KIP2 immunohistochemistry. Isto permitiu a subdivisão exata de concepções do HM baseadas na contribuição parental a seus genomes, como segue: chm, que são chimerism androgenética monospérmicos ou diploid androgenética diploid, e PHM, que são triploid, chimerism em 99% e monospérmicos em 1% dos casos5,6,7,8. Além disso, há um outro tipo genotípica de HM que emergiu nas duas décadas passadas, que é biparental diploid. O último é na maior parte periódico e pode afetar um único membro da família (casos simples) ou pelo menos dois membros da família (casos familial). Estas toupeiras biparental diploid são causadas na maior parte por mutações recessive em NLRP7 ou em KHDC3L nos pacientes9,10,11,12. O HM biparental diploid nos pacientes com mutações recessive em NLRP7 pode ser diagnosticado como o chm ou o PHM pela análise morfológica e este parece ser associado com a severidade das mutações nos pacientes13,14. Além da classificação de HM de acordo com seus genótipos, a introdução e o uso de vários métodos de genotipagem permitiram distinguir as diferentes entidades molares de abortos não-molar, tais como concepções biparentais diploides aneuploides e outros tipos de concepções5,15. Tais concepções podem ter alguma proliferação do trofoblasto e morfologia villous anormal que imitam, em certa medida, algumas características morfológicas de hm.
O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para genotipagem multiplex e citometria de fluxo de tecidos de parafina (FFPE) fixos em formalina, e análises abrangentes dos resultados desses métodos e sua integração com outros métodos para diagnóstico correto e conclusivo de tecidos molares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hm são gravidezes humanas anormais com etiologias heterogêneas e têm tipos histológicos e genotípica diferentes, que faz sua classificação exata e o diagnóstico que desafiam. A avaliação morfológica histopatológica foi provada frequentemente imprecisa e é conseqüentemente não confiável no seus próprios classificar HM em CHM e em PHM e distingui-los dos abortos do não-molar. Conseqüentemente, um diagnóstico exato do HM exige o uso de outros métodos tais como o Genotyping multiplex do ADN do microssat?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Sophie Patrier e Marianne Parésy por compartilharem o protocolo original de citometria de fluxo, e Promega e Qiagen para fornecimento de suprimentos e reagentes. Este trabalho foi apoiado pelo Réseau Québécois en reprodução e o Instituto canadense de pesquisa em saúde (MOP-130364) para o RS
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
