Microsatelliet DNA genotypering en flow Cytometrie ploidy analyses van Formalin-vaste paraffine-ingesloten Hydatidiforme molaire weefsels
Summary
Hydatidiforme mollen zijn abnormale humane zwangerschappen met heterogene etiologieën die kunnen worden geclassificeerd op basis van hun morfologische kenmerken en de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Hier worden protocollen van multiplex microsatelliet DNA-genotypering en Flowcytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten molaire weefsels gedetailleerd beschreven, samen met de interpretatie en integratie van resultaten.
Abstract
Hydatidiform Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door overmatige trophoblastische proliferatie en abnormale embryonale ontwikkeling. Er zijn twee soorten HM gebaseerd op microscopische morfologische evaluatie, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM). Deze kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Een dergelijke karakterisering van HM, door morfologie en genotype analyse, is cruciaal voor patiëntenbeheer en voor het fundamenteel begrip van deze intrigerende pathologie. Het is goed gedocumenteerd dat morfologische analyse van HM onderhevig is aan brede interobserver variabiliteit en niet voldoende is om HM nauwkeurig te classificeren in CHM en PHM en ze te onderscheiden van hydropic niet-molaire abortussen. Genotyping analyse wordt meestal uitgevoerd op DNA en weefsels van formalin-Fixed paraffine-embedded (FFPE)-producten van conceptie, die minder dan optimale kwaliteit hebben en bijgevolg tot verkeerde conclusies kunnen leiden. In dit artikel, gedetailleerde protocollen voor multiplex genotypering en flow cytometrie analyses van FFPE molaire weefsels worden verstrekt, samen met de interpretatie van de resultaten van deze methoden, hun probleemoplossing, en de integratie met de morfologische evaluatie , p57KIP2 immunohistochemie en fluorescentie in situ hybridisatie (Fish) om een correcte en robuuste diagnose te bereiken. Hier, de auteurs delen de methoden en lessen geleerd in de afgelopen 10 jaar van de analyse van ongeveer 400 producten van conceptie.
Introduction
Een Mola Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door abnormale embryonale ontwikkeling, Hyper proliferatie van de trofoblast, en hydropic degeneratie van chorion Villi (CV). In het verleden werd HM gebruikt om te worden onderverdeeld in twee typen, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM) alleen op basis van morfologische evaluatie1. Er is echter aangetoond dat morfologische evaluatie alleen niet volstaat om HM in de twee subtypen (chm en PHM) te classificeren en ze te onderscheiden van niet-molaire miskramen2,3,4.
Omdat CHM en PHM verschillende neiging hebben tot maligniteiten, is het daarom belangrijk om het genotypische type HM nauwkeurig te bepalen om de juiste follow-up en het beheer aan de patiënten te bieden. Bijgevolg zijn in de afgelopen decennia verschillende methodologieën ontwikkeld en geëvolueerd om de ouderlijke bijdrage aan de molaire weefsels te identificeren en een correcte classificatie van HM te bereiken. Deze omvatten karyotype analyse, chromosomale banding polymorfisme, humaan leukocyten antigeen (HLA) serologische typering, restrictie fragment lengte polymorfisme, variabel aantal tandem herhalingen, microsatelliet genotypering, flow cytometrie, en p57 KIP2 immunohistochemie. Dit heeft toegestaan nauwkeurige onderverdeling van HM-concepties op basis van de ouderlijke bijdrage aan hun genomes, als volgt: CHM, die diploïde Androgenetische monospermic of diploïde Androgenetische dispermic, en PHM, die zijn triploid, dispermic in 99% en monospermic in 1% van de gevallen5,6,7,8. Bovendien, er is een ander genotypische type HM dat ontstond in de afgelopen twee decennia, dat is diploïde biparentale. Deze laatste is meestal terugkerend en kan van invloed zijn op één gezinslid (simplex gevallen) of ten minste twee familieleden (familiaire gevallen). Deze diploïde biouderlijke mollen worden voornamelijk veroorzaakt door recessieve mutaties in NLRP7 of KHDC3L bij de patiënten9,10,11,12. Diploïde biparental HM bij patiënten met recessieve mutaties in NLRP7 kan worden gediagnosticeerd als chm of PHM door morfologische analyse en dit lijkt te zijn geassocieerd met de ernst van de mutaties bij de patiënten13,14. In aanvulling op de classificatie van HM volgens hun genotypes, de invoering en het gebruik van verschillende genotypering methoden toegestaan het onderscheid van de verschillende molaire entiteiten uit niet-molaire miskramen, zoals aneuploïde diploïde biouderlijke concepties en andere vormen van concepties5,15. Dergelijke opvattingen kunnen sommige trofoblast proliferatie en abnormale villus morfologie die, tot op zekere hoogte, sommige morfologische kenmerken van HM nabootsen.
Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen te bieden voor multiplex genotypering en flow cytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten (FFPE) weefsels, en uitgebreide analyses van de resultaten van deze methoden en hun integratie met andere methoden voor juiste en afdoende diagnose van molaire weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM zijn abnormale menselijke zwangerschappen met heterogene etiologieën en hebben verschillende histologische en genotypische soorten, wat hun nauwkeurige classificatie en diagnose uitdagend maakt. Histopathologische morfologische evaluatie werd vaak onnauwkeurig bevonden en is daarom onbetrouwbaar om HM in CHM en PHM te classificeren en te onderscheiden van niet-molaire miskramen. Daarom, een nauwkeurige diagnose van HM vereist het gebruik van andere methoden, zoals multiplex microsatelliet DNA genotypering, ploïdie a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Sophie Patrier en Marianne Parésy voor het delen van het originele flow cytometrie protocol, en Promega en Qiagen voor het leveren van voorraden en reagentia. Dit werk werd gesteund door de Réseau Québécois en reproductie en het Canadese Instituut voor gezondheidsonderzoek (MOP-130364) naar R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
