Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d’os maintiennent l’hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d’optimisation et un protocole pour la culture 3D d’échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l’aide de l’IFC.
La culture tridimensionnelle (3D) des organoïdes des spécimens de tumeur des patients humains et des modèles de xénogreffe (PDX) de patient-dérivé (PDX), désignés sous le nom d’organoïdes patient-dérivés (PDO), sont une ressource inestimable pour étudier le mécanisme de tumorigenesis et métastasie du cancer de la prostate. Leur principal avantage est qu’ils maintiennent l’hétérogénéité génomique et fonctionnelle distinctive du tissu original par rapport aux lignées cellulaires conventionnelles qui ne le font pas. En outre, les cultures 3D de l’ADP peuvent être utilisées pour prédire les effets du traitement médicamenteux sur les patients individuels et sont une étape vers la médecine personnalisée. Malgré ces avantages, peu de groupes utilisent régulièrement cette méthode en partie en raison de l’optimisation étendue des conditions de culture des APR qui peuvent être nécessaires pour différents échantillons de patients. Nous avons précédemment démontré que notre modèle de métastasie d’os de prostate PDX, PCSD1, a récapitulé la résistance de la métaste d’os du patient de distributeur au traitement d’anti-androgène. Nous avons employé des organoïdes 3D de PCSD1 pour caractériser plus loin les mécanismes de la résistance d’anti-androgène. À la suite d’un aperçu des études actuellement publiées sur les modèles PDX et ADP, nous décrivons un protocole étape par étape pour la culture 3D de l’ADO à l’aide de membranes en dôme ou flottantes (p. ex. Matrigel) dans des conditions de culture optimisées. L’imagerie in vivo de point et le traitement cellulaire pour l’histologie sont également décrits. Ce protocole peut être optimisé pour d’autres applications, y compris la tache occidentale, la co-culture, etc. et peut être utilisé pour explorer les caractéristiques de l’AOP cultivé en 3D concernant la résistance aux médicaments, la tumorigénèse, la métastes et la thérapeutique.
Les organoïdes cultivés tridimensionnels ont attiré l’attention sur leur potentiel de récapituler l’architecture in vivo, la fonctionnalité cellulaire et la signature génétique de leurs tissus d’origine1,2,3,4,5. Plus important encore, les organoïdes 3D établis à partir de tissus tumoraux patients ou de xénogreffes dérivées du patient (PDX) modèles fournissent des occasions inestimables de comprendre les mécanismes de signalisation cellulaire sur la tumorigénèse et de déterminer les effets du traitement médicamenteux sur chaque population cellulaire6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et coll.5 ont élaboré un protocole standard pour l’établissement d’organoïdes de la prostate humains et souris, qui a été largement adopté dans le domaine de l’urologie. En outre, un effort significatif a été consacré pour la caractérisation des organoïdes 3D et de comprendre les mécanismes détaillés de la tumorigénèse et la métastes4,12,14,15. En plus du protocole précédemment établi et largement accepté pour les cultures d’organoïdes 3D, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la culture 3D de PDO utilisant trois méthodes différentes de doming dans des conditions de culture optimisées.
Dans ce manuscrit, des organoïdes 3D ont été établis comme modèle ex vivo du cancer de la prostate métastatique d’os (BMPC). Les cellules utilisées pour ces cultures provenaient de la prostate Cancer San Diego (PCSD) série et ont été dérivés directement de patients cancer de la prostate os métastatique tissus tumoraux (PCSD18 et PCSD22) ou le patient dérivé xénogreffe (PDX) modèles tumoraux (échantillons nommés PCSD1, PCSD13, et PCSD17). Parce que la métastase spontanée d’os des cellules cancéreuses de la prostate est rare dans les modèles génétiquement modifiés de souris16,nous avons employé l’injection intra-fémorale directe (IF) des cellules humaines de tumeur dans le Rag2 mâle -/–c——souris pour établir les modèles de PDX du cancer de la prostate métastatiqued’os 17.
Une fois que les organoïdes 3D sont établis à partir des cellules hétérogènes de tumeur patiente ou des xénogreffes dérivées de patient, il est essentiel de confirmer leur identité en tant que cellules de tumeur de prostate et de déterminer leurs phénotypes dans les cultures organoïdes 3D. La chimie de l’immunofluorescence (IFC) permet la visualisation de l’expression des protéines in situ dans chaque cellule, indiquant souvent les fonctions potentielles pour des populations cellulaires spécifiques2,4. En général, les protocoles IFC pour une grande majorité d’échantillons, y compris les tissus et les cellules, sont simples et entièrement optimisés. Cependant, la densité cellulaire et le nombre d’organoïdes peuvent être significativement inférieurs à ceux de la culture conventionnelle. Par conséquent, le protocole de l’IFC pour les organoïdes nécessite des mesures supplémentaires pour assurer un traitement approprié et l’intégration de la paraffine pour tous les organoïdes dans les échantillons. Nous décrivons des étapes supplémentaires pour un processus de pré-embedding d’agarose et des bouts pour étiqueter l’emplacement des organoïdes sectionnés sur la glissière qui augmente le taux de succès de l’IFC sur des organoïdes particulièrement quand les échantillons des organoïdes ont la densité cellulaire inférieure que désiré.
Les organoïdes 3D dérivés des cellules cancéreuses de prostate de métastasie d’os patient sont encore relativement rares. Ici, nous décrivons des stratégies et le protocole optimisé de nouveau pour établir avec succès les organoïdes dérivés de patient 3D de série (PDO) de BMPC. En outre, des protocoles sont décrits pour fixer les organoïdes dans les échantillons avec la densité cellulaire inférieure pour l’analyse d’IFC et d’IHC. Les phénotypes différentiels sous forme de kyste, de sphéroïdes et d’…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par la Leo and Anne Albert Charitable Foundation et la JM Foundation. Nous remercions les membres du Centre de cancérologie de l’Université de Californie à San Diego Moores, le Dr Jing Yang et le Dr Kay T. Yeung de nous avoir permis l’utilisation de leur microtome et Randall Français, département de chirurgie pour l’expertise technique.
1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
Agarose | Lonza | 50000 | |
Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
B27 | Life Technologies | 17504044 | |
Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
Marker | VWR | 52877-355 | |
Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin | PeproTech | 120-10C | |
OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Parafilm | American National Can | N/A | |
Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |