Los cultivos tridimensionales de muestras BMPC pacientes y xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico óseo mantienen la heterogeneidad funcional de sus tumores originales, lo que resulta en quistes, esferoides y organoides complejos similares a tumores. Este manuscrito proporciona una estrategia de optimización y protocolo para el cultivo 3D de muestras derivadas de pacientes heterogéneos y su análisis utilizando IFC.
El cultivo tridimensional (3D) de organoides a partir de muestras tumorales de pacientes humanos y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata, conocidos como organoides derivados del paciente (DOP), son un recurso invaluable para estudiar el mecanismo de tumorigenesis y metástasis del cáncer de próstata. Su principal ventaja es que mantienen la heterogeneidad genómica y funcional distintiva del tejido original en comparación con las líneas celulares convencionales que no lo hacen. Además, los cultivos 3D de DOP se pueden utilizar para predecir los efectos del tratamiento farmacológico en pacientes individuales y son un paso hacia la medicina personalizada. A pesar de estas ventajas, pocos grupos utilizan rutinariamente este método en parte debido a la amplia optimización de las condiciones de cultivo de DOP que pueden ser necesarias para diferentes muestras de pacientes. Anteriormente demostramos que nuestro modelo PDX de metástasis ósea de cáncer de próstata, PCSD1, recapitulaba la resistencia de la metástasis ósea del paciente donante a la terapia antiandrógeno. Utilizamos organoides PCSD1 3D para caracterizar aún más los mecanismos de resistencia a los antiandrógenos. Siguiendo una visión general de los estudios publicados actualmente de los modelos PDX y PDO, describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando esferas de membrana de sótano abovedada o flotante (por ejemplo, Matrigel) en condiciones de cultivo optimizadas. También se describen las imágenes de puntadas in vivo y el procesamiento celular para histología. Este protocolo se puede optimizar aún más para otras aplicaciones, incluyendo la mancha occidental, la cocultura, etc. y se puede utilizar para explorar las características de la DOP cultivada en 3D relacionadas con la resistencia a los medicamentos, la tumorigenesis, la metástasis y las terapias.
Los organoides cultivados tridimensionales han llamado la atención por su potencial para recapitular la arquitectura in vivo, la funcionalidad celular y la firma genética de sus tejidos originales1,2,3,4,5. Lo más importante es que los organoides 3D establecidos a partir de tejidos tumorales de pacientes o modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) proporcionan oportunidades inestimables para comprender los mecanismos de señalización celular sobre la tumorigenesis y determinar los efectos del tratamiento farmacológico en cada población celular6,7,8,9,10,11,12,13. 5 desarrolló un protocolo estándar para el establecimiento de organoides de próstata humanos y de ratón, que ha sido ampliamente adoptado en el campo de la urología. Además, se ha dedicado un esfuerzo significativo para una mayor caracterización de los organoides 3D y para comprender los mecanismos detallados de la tumorigenesis y la metástasis4,12,14,15. Además del protocolo previamente establecido y ampliamente aceptado para las culturas de organoides 3D, aquí describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando tres métodos de doming diferentes en condiciones de cultivo optimizadas.
En este manuscrito, los organoides 3D se establecieron como un modelo ex vivo de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC). Las células utilizadas para estos cultivos provenían de la serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) y se derivaron directamente de los tejidos tumorales metastásicos del cáncer de próstata del paciente (PCSD18 y PCSD22) o de los modelos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) (muestras denominadas PCSD1, PCSD13 y PCSD17). Debido a que la metástasis ósea espontánea de las células cancerosas de próstata es poco frecuente en los modelos de ratón genéticamente modificados16, utilizamos la inyección directa intrafemoral (IF) de células tumorales humanas en machos Rag2-/-c-/- ratones para establecer los modelos PDX del cáncer de próstata metastásico óseo17.
Una vez que los organoides 3D se establecen a partir de células tumorales de pacientes heterogéneos o xenoinjertos derivados del paciente, es esencial confirmar su identidad como células tumorales de próstata y determinar sus fenotipos en los cultivos organoides 3D. La química de la inmunofluorescencia (IFC) permite la visualización de la expresión proteica in situ en cada célula, a menudo indicando las funciones potenciales para poblaciones celulares específicas2,4. En general, los protocolos IFC para una gran mayoría de muestras, incluidos los tejidos y las células, son sencillos y están totalmente optimizados. Sin embargo, la densidad celular y el número de organoides pueden ser significativamente menores que la del cultivo convencional. Por lo tanto, el protocolo IFC para organoides requiere pasos adicionales para asegurar el procesamiento adecuado y la inserción en parafina para todos los organoides en las muestras. Describimos pasos adicionales para un proceso de preincrustación de agarosa y consejos para etiquetar la ubicación de organoides seccionados en la diapositiva que aumenta la tasa de éxito de IFC en organoides, especialmente cuando las muestras de organoides tienen menor densidad celular de la deseada.
Los organoides 3D derivados de las células de cáncer de próstata de metástasis ósea del paciente son todavía relativamente raros. Aquí, describimos estrategias y protocolo optimizado para establecer con éxito organoides derivados de pacientes 3D en serie (DOP) de BMPC. Además, los protocolos se describen para asegurar los organoides en muestras con menor densidad celular para el análisis ifC e IHC. Los fenotipos diferenciales en forma de quiste, esferoides y organoides más complejos indican que este protocolo …
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por la Fundación Caritativa Leo y Anne Albert y la Fundación JM. Agradecemos a los miembros del Centro Oncológico de la Universidad de California En San Diego Moores, el Dr. Jing Yang y el Dr. Kay T. Yeung por permitirnos el uso de su microtome y Randall French, Departamento de Cirugía para la experiencia técnica.
1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
Agarose | Lonza | 50000 | |
Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
B27 | Life Technologies | 17504044 | |
Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
Marker | VWR | 52877-355 | |
Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin | PeproTech | 120-10C | |
OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Parafilm | American National Can | N/A | |
Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |