Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi
Summary
Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.
Abstract
İnsan hastalarının tümör örneklerinden organoidlerin üç boyutlu (3D) kültürü ve hasta kaynaklı organoidler (PDO) olarak adlandırılan prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, tümörigenez ve prostat kanseri metastazı. Onların en büyük avantajı, orijinal dokunun ayırt edici genomik ve fonksiyonel heterojenliğini geleneksel hücre hatlarına göre korumalarıdır. Ayrıca, PDO’nun 3D kültürleri ilaç tedavisinin bireysel hastalar üzerindeki etkilerini tahmin etmek için kullanılabilir ve kişiselleştirilmiş tıbba doğru atılmış bir adımdır. Bu avantajlara rağmen, farklı hasta örnekleri için gerekli olabilecek PDO kültür koşullarının kapsamlı optimizasyonu nedeniyle bu yöntemi rutin olarak çok az grup kullanmaktadır. Daha önce prostat kanseri kemik metastazı PDX modelimizin PCSD1’in donör hastanın kemik metastazının anti-androjen tedavisine direncini yeniden kapladığını gösterdik. Biz anti-androjen direnci daha fazla mekanizmaları karakterize PCSD1 3D organoidler kullanılır. PDX ve PDO modellerinin şu anda yayınlanmış çalışmalarının genel bir görünümünü takiben, optimize edilmiş kültür koşullarında kubbeli veya yüzen bazal membran (örneğin, Matrigel) küreler kullanarak PDO’nun 3B kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz. In vivo dikiş görüntüleme ve histoloji için hücre işleme de açıklanmıştır. Bu protokol batı leke, co-kültür, vb dahil olmak üzere diğer uygulamalar için daha optimize edilebilir ve ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve terapötik ile ilgili 3D kültürlü PDO özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir.
Introduction
Üç boyutlu kültürlü organoidler in vivo mimarisi, hücresel işlevsellik ve orijinal dokularının genetik imza sını yeniden özetleme potansiyelleri için dikkatçekti1 ler 1,2,3,4,5. En önemlisi, hasta tümör dokularından veya hasta türetilmiş ksenogreft (PDX) modellerinden kurulan 3D organoidler, tümörigenez üzerine hücresel sinyalizasyon mekanizmalarını anlamak ve ilaç tedavisinin her hücre popülasyonu6,7,8,9,10,11,12,13üzerindeki etkilerini belirlemek için paha biçilmez fırsatlar sağlar. Drost ve ark.5 üroloji alanında yaygın olarak benimsenen insan ve fare prostat organoidlerinin kurulması için standart bir protokol geliştirmiştir. Buna ek olarak, 3D organoidlerin daha fazla karakterizasyonu ve tümörigenez ve metastaz4,12,14,15ayrıntılı mekanizmaları anlamak için önemli çaba adanmıştır. 3D organoid kültürleri için önceden belirlenmiş ve yaygın olarak kabul görmüş protokole ek olarak, optimize edilmiş kültür koşullarında üç farklı doming yöntemi kullanılarak PDO’nun 3D kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz.
Bu yazıda kemik metastatik prostat kanserinin (BMPC) ex vivo modeli olarak 3Boyutlu organoidler oluşturulmuştur. Bu kültürler için kullanılan hücreler Prostat Kanseri San Diego (PCSD) serisi geldi ve doğrudan hasta prostat kanseri kemik metastatik tümör dokuları (PCSD18 ve PCSD22) veya hasta türetilen ksenogreft (PDX) tümör modelleri (pcsd1, PCSD13 ve PCSD17 adlı örnekler) türetilmiştir. Prostat kanseri hücrelerinin spontan kemik metastazı genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde nadir olduğu için16, biz erkek Rag2 içine insan tümör hücrelerinin doğrudan intra-femoral (IF) enjeksiyonu kullanılan-/-γc-/- fareler kemik metastatik prostat kanseri PDX modelleri kurmak için17.
3D organoidler heterojen hasta tümör hücrelerinden veya türetilmiş ksenogreftlerden oluşturulduktan sonra, prostat tümör hücreleri olarak kimliklerini doğrulamak ve 3D organoid kültürlerde fenotiplerini belirlemek esastır. İmmünofloresan kimyası (IFC) her hücrede protein ekspresyonunun görüntülenmesine izin verir, genellikle belirli hücre popülasyonları için potansiyel işlevleri gösteren2,4. Genel olarak, dokular ve hücreler de dahil olmak üzere örneklerin büyük bir çoğunluğu için IFC protokolleri basit ve tamamen optimize edilebistir. Ancak, hücre yoğunluğu ve organoidlerin sayısı önemli ölçüde konvansiyonel kültürdaha düşük olabilir. Bu nedenle, organoidler için IFC protokolü, numunelerdeki tüm organoidler için parafinin uygun şekilde işlenmesini ve gömülmesini sağlamak için ek adımlar gerektirir. Özellikle organoid örneklerinin hücre yoğunluğunun istenildiğinde nisbeten daha düşük olması durumunda, akderose ön gömme işlemi için ek adımlar ve kesitli organoidlerin yerini slaytta etiketlemek için ipuçları açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta kemik metastazı prostat kanseri hücrelerinden elde edilen 3D organoidler hala nispeten nadirdir. Burada, BMPC’nin seri 3D hasta kaynaklı organoidlerini (PDO’ları) başarıyla kurmak için stratejileri ve daha da optimize edilmiş protokolü tanımlıyoruz. Buna ek olarak, IFC ve IHC analizi için daha düşük hücre yoğunluğuna sahip numunelerde organoidlerin güvenliğini sağlamak için protokoller tanımlanmıştır. Kist, sferoidler ve daha karmaşık organoidler şeklindeki diferansiyel fenotipler, bu p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Leo ve Anne Albert Charitable Vakfı ve JM Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz California Üniversitesi San Diego Moores Kanser Merkezi üyeleri, Dr Jing Yang ve Dr Kay T. Yeung bize teknik uzmanlık için mikrotom ve Randall Fransızca, Cerrahi Bölümü kullanımı izin için teşekkür ederiz.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
