Etablering og analyse av tredimensjonale (3D) organoider avledet fra pasient prostatakreft benmetastase prøver og deres Xenografts
Summary
Tredimensjonale kulturer av pasient BMPC prøver og xenografts av bein metastatisk prostatakreft opprettholde funksjonell heterogenitet av sine opprinnelige svulster resulterer i cyster, sfæroider og komplekse, tumor-lignende organoider. Dette manuskriptet gir en optimaliseringsstrategi og protokoll for 3D-kultur av heterogene pasientavledede prøver og deres analyse ved hjelp av IFC.
Abstract
Tredimensjonal (3D) kultur av organoider fra tumorprøver av menneskelige pasienter og pasientavledede xenograft (PDX) modeller av prostatakreft, referert til som pasientavledede organoider (PUD), er en uvurderlig ressurs for å studere mekanismen for tumorigenese og metastase av prostatakreft. Deres største fordel er at de opprettholder den karakteristiske genomiske og funksjonelle heterogeniteten til det opprinnelige vevet sammenlignet med konvensjonelle cellelinjer som ikke gjør det. Videre kan 3D-kulturer av PUD brukes til å forutsi effekten av legemiddelbehandling på individuelle pasienter og er et skritt mot personlig medisin. Til tross for disse fordelene bruker få grupper rutinemessig denne metoden delvis på grunn av den omfattende optimaliseringen av PUD-kulturforhold som kan være nødvendig for ulike pasientprøver. Vi har tidligere vist at vår prostatakreft bein metastase PDX modell, PCSD1, rekapitulert motstanden av donor pasientens bein metastase til anti-androgen terapi. Vi brukte PCSD1 3D organoider for å karakterisere ytterligere mekanismene for anti-androgenmotstand. Etter en oversikt over publiserte studier av PDX- og PUD-modeller, beskriver vi en trinnvis protokoll for 3D-kultur av PUD ved hjelp av domed eller flytende kjellermembran (f.eks. Matrigel) sfærer i optimaliserte kulturforhold. In vivo søm avbildning og cellebehandling for histologi er også beskrevet. Denne protokollen kan videre optimaliseres for andre applikasjoner, inkludert vestlig blot, co-kultur, etc. og kan brukes til å utforske egenskapene til 3D-kultivert PUD knyttet til resistens, tumorigenese, metastase og terapeutiske midler.
Introduction
Tredimensjonale kultiverte organoider har trukket oppmerksomhet for deres potensial til å rekapitulere in vivo arkitektur, cellulær funksjonalitet og genetisk signatur av deres opprinnelige vev1,2,3,4,5. Viktigst, 3D organoider etablert fra pasient tumor vev eller pasient avledet xenograft (PDX) modeller gir uvurderlige muligheter til å forstå mekanismer for cellulær signalering på tumorigenese og for å bestemme effekten av narkotikabehandling på hver cellepopulasjon6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 utviklet en standardprotokoll for etablering av humane og mus prostata organoider, som har blitt mye vedtatt innen urologi. I tillegg har betydelig innsats vært dedikert for ytterligere karakterisering av 3D organoider og for å forstå de detaljerte mekanismene for tumorigenese og metastase4,12,14,15. I tillegg til den tidligere etablerte og allment aksepterte protokollen for 3D-organoider kulturer, beskriver vi her en trinnvis protokoll for 3D-kulturen i PUD ved hjelp av tre forskjellige domingmetoder i optimaliserte kulturforhold.
I dette manuskriptet ble 3D organoider etablert som en ex vivo-modell av benmetastatisk prostatakreft (BMPC). Cellene som brukes for disse kulturene kom fra Prostatakreft San Diego (PCSD) serien og ble avledet direkte fra pasient prostatakreft bein metastatisk tumor vev (PCSD18 og PCSD22) eller pasient avledet xenograft (PDX) tumormodeller (prøver kalt PCSD1, PCSD13, og PCSD17). Fordi spontan benmetastase av prostatakreftceller er sjelden i genmodifiserte musemodeller16,brukte vi direkte intra-femoral (IF) injeksjon av humane tumorceller i mannlige Rag2-/-γc-/- mus for å etablere PDX-modellene av benmetastatisk prostatakreft17.
Når 3D organoider er etablert fra heterogene pasient tumorceller eller pasient avledet xenografts, er det viktig å bekrefte sin identitet som prostata tumorceller og for å bestemme sine fenotyper i 3D organoid kulturer. Immunfluorescenskjemi (IFC) tillater visualisering av proteinuttrykk in situ i hver celle, ofte indikerer de potensielle funksjonene for bestemte cellepopulasjoner2,4. Generelt er IFC-protokoller for et stort flertall av prøver, inkludert vev og celler enkle og fullt optimaliserte. Imidlertid kan celletettheten og antall organoider være betydelig lavere enn for konvensjonell kultur. Derfor krever IFC-protokollen for organoider ytterligere trinn for å sikre riktig behandling og innebygging i parafin for alle organoider i prøvene. Vi beskriver flere trinn for en agarose pre-embedding prosess og tips for å merke plasseringen av seksjonerte organoider på lysbildet som øker suksessraten til IFC på organoider, spesielt når prøvene av organoider har lavere celletetthet enn ønsket.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D organoider avledet fra pasientens benmetastase prostatakreftceller er fortsatt relativt sjeldne. Her beskriver vi strategier og ytterligere optimalisert protokoll for å etablere seriell 3D-pasient avledet organoider (PDOer) av BMPC. I tillegg er protokoller beskrevet for å sikre organoider i prøver med lavere celletetthet for IFC og IHC analyse. Differensialfetyper i form av cyste, sfæroider og mer komplekse organoider indikerer at denne protokollen gir kulturforhold som gjør det mulig for heterogonøse tumorcell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Leo og Anne Albert Charitable Foundation og JM Foundation. Vi takker University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmer, Dr. Jing Yang og Dr. Kay T. Yeung for å tillate oss bruk av deres mikrotome og Randall French, Department of Surgery for teknisk ekspertise.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- . Keyence Fluorescence Microscope Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019)
