ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות
Summary
פרוטוקול זה מספק הוראות להטמעת ליתופי מולטיפוטון כדי להמציא מערכים תלת-ממדיים של סמנים fiducial פלורסנט מוטבע פולי (אתילן גליקול) מבוססי הידרוג לשימוש כמו ללא התייחסות, כוח המתיחה מיקרוסקופ פלטפורמות. באמצעות הוראות אלה, מדידה של זן חומר תלת-ממד וחישוב של תיחות הסלולר הוא פשוט כדי לקדם תפוקה גבוהה כוח המתיחה מדידות.
Abstract
עיוות חומרים המושרה על-ידי תא מספק מידע שימושי בנוגע לאופן התחושה של תאים ולתגובה למאפיינים הפיזיים של סביבת המיקרו שלהם. בעוד שגישות רבות קיימות למדידת זן החומר המושרה בתא, כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור המתח עם החלטה תת מיקרון באופן חופשי התייחסות. באמצעות שימוש בשני פוטון המופעלות פוטוגרפיה תהליך, אנו מדגימים כיצד ליצור מכני ביו-אקטיבי מצעים סינתטיים המכילים מערכים מוטבעים של fiducial סמנים פלורסנט כדי למדוד בקלות תלת מימדי ( 3D) לדפורמציה החומר פרופילים בתגובה לפני השטח. בעזרת מצעים אלה, ניתן למפות פרופילי מתח בתא באמצעות מחסנית אחת של תמונה תלת-ממדית של תא מעניין. המטרה שלנו עם מתודולוגיה זו היא להפוך כוח המתיחה מיקרוסקופ קל יותר ויותר ליישם כלי עבור חוקרים לומד תהליכים מכניזציה הסלולר, במיוחד חדשים לשדה.
Introduction
מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) הוא תהליך של מקורב הסלולר באמצעות שדות הזחה באינטרפולציה של fiducial סמנים שנוצרו על ידי התאים חסיד ו הקונאקטולה. באמצעות tfm, ההשפעה של רמזים מכניים בסביבה החילוץ על תהליכים סלולריים חשובים כגון התפשטות, בידול, והגירה ניתן לחקור1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12 למרבה הצער, גישות קיימות רבות יכול להיות קשה ליישם או לדרוש היכרות עם כלים אנליטיים מיוחדים מאוד חישובית עושה TFM קשה לחוקרים מנוסים להשתמש. אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת פלטפורמת TFM המבטל חלק מהקושי בניתוח תוך מתן התפוקה הגבוהה לרכישת נתונים.
מבין הגישות הקיימות של TFM, הנפוצות ביותר לשימוש בחומרי מימוש בחומר כולל בשילוב של סמני פלורסנט קטנים (בדרך כלל מחרוזות פלורסנט בגודל ננו או מיקרומטר) להידרוג’ל מעוות, כגון פוליאקרילאמיד (צפות) או פולי (אתילן גליקול) דיאקריל (pegda)13,14,15. גישות אלה מבוססות חרוז מספקות את היכולת לfiducial סמנים באשכולות סביב תא מעניין כדי למקסם את דגימת העקירה. למרבה הצער, התפלגות החרוזים ברחבי ההידרוג’ל אינה יכולה להיות נשלטת ישירות כך שהארגון המרחבי הוא אקראי. מיקום אקראי זה מוביל בעיות כגון חרוזים שהם קרובים מדי זה לזה כדי לפתור במדויק, או כל כך להפיץ כי טלאים של המצע להניב נתונים באיכות נמוכה. חוסר היכולת לנבא היכן סמנים fiducial לשקר בהעדר תאים גם יוצר אילוץ כי, עבור כל קבוצה שנאסף של נתוני המתיחה תא, תמונת התייחסות נוספת של סמנים הבסיסיים במצב רגוע חייב גם להילכד. תמונת הייחוס נדרשת כך שההזחה בתמונה ההתוחה יכולה להיות מתקרבת כהפרש בין התמונות ההתוחות והבלתי מתוחות. כדי להשיג מדינה רגועה, התאים הנמדדים הם נינוחים כימיים או מוסרים לחלוטין. תהליך זה מונע לעתים קרובות רכישה של מדידות נסיוניות נוספות, מעכב מחקרי תאים ארוכי טווח ומגביל תפוקה. תמונת ייחוס דורש גם טכניקות רישום התמונה כדי להתאים את הסחף אשר ייתכן שהתרחשו במהלך הניסויים, לעתים קרובות מוביל התאמת ידני מסורבלת של תמונות מצב הלחץ כדי להפנות לתמונות.
שיטות tfm אחרות הנחשבות ללא התייחסות, מיישמים צורה כלשהי של שליטה על התפלגות fiducial סמנים, או על-ידי ליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה, הדפסת מיקרואיש קשר או מיקרואודינג16,17,18 ,19,20. הפניה חינם TFM מושגת באמצעות ההנחה כי המדינה רגועה עבור כל סמן fiducial ניתן לחזות בהתבסס על איך סמן עמדות נקבעו במהלך תהליך הייצור. שיטות אלה מאפשרות לכידה מלאה של מצב המתח של התא בתוך לכידת תמונה אחת שבה fiducial marker displacements נמדדים בהשוואה להפניה משתמעת מאשר ניתן להסיק מהגאומטריה fiducial marker. בעוד עקביות במיקום הסמן מושגת בדרך כלל באמצעות פלטפורמות אלה, הם בדרך כלל סובלים החסרונות שלהם ביחס מבוססי חרוזים נרחב הגישות כולל: 1) ירידה ברזולוציית המתיחה; 2) דיוק מופחת של displacements מחוץ למישור (במקרים מסוימים חוסר יכולת מלאה למדוד); ו-3) ירידה ביכולת ההתאמה האישית של מצעים וחומרי הפלטפורמה (למשל, ליגיום ומצגת, תכונות מכניות).
כדי לטפל בחסרונות האלה, עיצבנו פלטפורמת TFM חדשה ללא התייחסות. הפלטפורמה מנצל מרובת פוטון כימיה מופעל כדי crosslink נפח קטן של fluorophore לתוך מיקומים תלת-ממד ספציפיים בתוך ההידרוג’ל המשמשים כסמנים fiducial למדוד חומר להתאמץ. בדרך זו, עיצבנו פלטפורמה הפועלת באופן דומה לגישות המבוססות על חרוזים, אך עם התועלת המשמעותית שfiducial סמנים מאורגנים לתוך מערכים מסוג gridded המאפשרים מעקב אחר החומרים ללא התייחסות. מאפיין זה נטול התייחסות מעניק יתרונות רבים. בראש ובראשונה, זה מאפשר ניטור לא פולשנית של מצבי המתיחה הסלולר (כלומר, לעקוף את הצורך להירגע או להסיר תאים כדי לרכוש עמדות התייחסות של עקורים fiducial סמנים). זו הייתה המטרה העיקרית שלנו בעיצוב מערכת זו, כפי שהתכוונו לשלב שיטות אנליטיות אחרות במורד הזרם עם TFM, אשר יכול להיות קשה עם גישות הרסניות TFM נקודות. שנית, שימוש בהפניה משתמעת המבוססת על מערכי gridded מאפשר אוטומציה של ניתוח הזחה כמעט מלאה. הערכים החריגים של המערכים יוצרים זרימת עבודה צפויה שבה התרחשות של מקרים יוצאי דופן (כלומר, נתוני תא לדוגמה המכילים פריטים שאינם צפויים כגון ריווח סמן או אי התאמות של רישום) יכולים להישמר במינימום. שלישית, הצורך לרכוש תמונת ייחוס מספק את החופש לפקח על תאים רבים במדגם אחד על פני פרקי זמן ארוכים. זה ניגודים עם גישות מסורתיות חרוז מסורתי, שם, בהתאם לנאמנות של תנועות הבמה אוטומטי של המיקרוסקופ, שגיאות במיקום יכול להצטבר ולהגדיל את הקושי של רישום כראוי התייחסות תמונות למתח התא תמונות. באופן כללי, פלטפורמה זו מקלה על תפוקה גבוהה יותר באיסוף נתוני מתח סלולריים.
עם פרוטוקול זה, אנו מקווים להכיר את הקוראים עם שני פוטון, לייזר בטכניקת סריקת הסריקה שאנו מיושם כדי ליצור את פלטפורמת TFM התייחסות זו למדוד מטוס ומחוץ למטוס רכיבי המתיחה שנוצר על ידי תאים שנזרע על פני השטח. לא מכוסה בפרוטוקול זה הוא סינתזה של חלק ממרכיבי monomeric. באופן כללי, התגובות הללו כוללות מערכת תגובת סינתזה “אחת-סיר” כמעט זהה, שתוארה קודם לכן21, וניתן גם לרכוש חלופות למוצרים אלה. אנו גם מכוונים להכיר את הקוראים עם הכלים המבוססים על תוכנה שיצרנו כדי לקדם את השימוש של מיקרוסקופ לייזר מסחרית לסרוק מיקרוסקופים כמו כלים 3D הדפסה כדי להקל על ניתוח של displacements marker fiducial.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה הקלה על רוב הקושי המשויך ליצירה ולניתוח של נתוני TFM. ברגע שהוכנו, הידרוג פוטומטריה הם פשוטים לשימוש, המחייב רק ידע של שיטות סטנדרטיות של תרבות רקמה ומיקרוסקופ פלואורסצנטית. ההיבט ללא התייחסות מאפשר ניווט שאנן על הידרו-לאדן תאים ומבטל שלבים מסורבלת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O. A. Banda נתמך על ידי מימון של NSF IGERT SBE2 מלגת (1144726), כספי הפעלה שסופקו על ידי אוניברסיטת דלאוור, ואת המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לסרטן IMAT תוכנית (R21CA214299). JHS נתמך על ידי מימון מן המוסדות הלאומיים של בריאות/המכון הלאומי לסרטן IMAT תוכנית (R21CA214299) ואת התוכנית הלאומית למדע בקרן פרס (1751797). גישה מיקרוסקופית הייתה נתמכת על ידי מענקים מ-NIH-כP20 GM103446), הNSF (IIA-1301765) ומדינת דלאוור. מיקרוסקופ תאורה מובנית נרכשה עם כספים ממדינת דלאוור מחקר הפדרלי תוכנית מענק הפיתוח (16A00471). המיקרוסקופ LSM880 קונפוקלית המשמש לליטוגרפיה דו-פוטון לייזר לסרוק, נרכשה עם מענק מכשור משותף (S10 OD016361).
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
References
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
- Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103 (2015).
- Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
- Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
- Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
- Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).
- Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
- Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
- Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
- Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
- Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
- Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
- . Slater Lab Code Repositories Available from: https://github.com/SlaterLab (2019)
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
- Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
- Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).
