Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform
Summary
Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.
Abstract
Kwantificerende cel-geïnduceerde materiaal vervorming biedt nuttige informatie over hoe cellen voelen en reageren op de fysieke eigenschappen van hun micro-omgeving. Hoewel er veel benaderingen bestaan voor het meten van de cel-geïnduceerde materiaal belasting, hier bieden we een methodologie voor het bewaken van stam met sub-micron resolutie in een referentie vrije manier. Met behulp van een geactiveerd fotolithografisch patronen-proces met twee fotonen laten we zien hoe mechanisch en biologisch actieve afstembaar synthetische substraten met ingesloten arrays van fluorescerende fiducial markers kunnen worden gegenereerd om eenvoudig driedimensionaal te meten ( 3D) materiaal vervormings profielen in reactie op oppervlakte tracties. Met behulp van deze substraten kunnen celspanningprofielen worden toegewezen met behulp van een enkele 3D-afbeeldingsstapel van een cel van belang. Ons doel met deze methodologie is om tractiekracht microscopie een toegankelijker en gemakkelijker te implementeren instrument voor onderzoekers die cellulaire mechanotransductie processen bestuderen, vooral nieuwkomers op het gebied te maken.
Introduction
Traction Force microscopie (TFM) is het proces van het benaderingen van cellulaire tracties met behulp van geïntermuleerde verplaatsings velden van fiducial markers gegenereerd door een aanhanger en contractiele cel. Met behulp van tfm, de invloed van mechanische aanwijzingen in de extracellulaire omgeving op belangrijke cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie, en migratie kan worden onderzocht1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Helaas, veel bestaande benaderingen kunnen moeilijk te implementeren of vereisen vertrouwdheid met zeer gespecialiseerde analytische en computationele instrumenten waardoor TFM moeilijk voor onervaren onderzoekers om te gebruiken. We beschrijven een methodologie om een TFM-platform te genereren dat een deel van de moeilijkheidsgraad elimineert, terwijl het ook gegevensverzameling met hoge doorvoer oplevert.
Van de bestaande TFM-benaderingen omvat de meest gebruikte voor het kwantificeren van materiaal stam het opnemen van kleine fluorescerende markers (meestal nano-of micrometer-sized fluorescerende kralen) in een vervormbare hydrogel, zoals Polyacrylamide (PAA) of poly (ethyleenglycol) diacrylaat (pegda)13,14,15. Deze kraal-gebaseerde benaderingen bieden de mogelijkheid om dicht cluster fiducial markers rond een cel van belang voor het maximaliseren van de verplaatsing steekproeven. Helaas kan de verdeling van de parels in de hydrogel niet direct worden geregeld, zodat de ruimtelijke ordening willekeurig is. Deze willekeurige plaatsing leidt tot problemen zoals kralen die te dicht bij elkaar zijn om nauwkeurig op te lossen, of zo verspreid dat patches van de ondergrond lage kwaliteitsgegevens opleveren. Het onvermogen om te voorspellen waar fiducial markers liggen in de afwezigheid van cellen creëert ook een beperking dat, voor elke verzamelde set van cel tractie gegevens, ook een extra referentiebeeld van de onderliggende markeringen in een ontspannen toestand moet worden vastgelegd. De referentieafbeelding is vereist, zodat verplaatsing in het beklemtoonde beeld kan worden benaderd als het verschil tussen de gestreste en onbeklemtoonde beelden. Om een ontspannen toestand te bereiken, zijn de cellen die worden gemeten ofwel chemisch ontspannen ofwel volledig verwijderd. Dit proces voorkomt vaak de verwerving van verdere experimentele metingen, remt de lange termijn celstudies, en beperkt de doorvoer. Een referentiebeeld vereist ook beeldregistratie technieken om tegemoet te komen aan drift die kan hebben plaatsgevonden tijdens experimenten, vaak leidend tot omslachtige Handmatige afstemming van stress State beelden om te verwijzen naar afbeeldingen.
Andere tfm-methoden die als referentie vrij worden beschouwd, implementeren enige vorm van controle over de distributie van fiducial markers, hetzij door middel van hoge resolutie lithografie, micro contactafdrukken, of micro molding16,17,18 ,19,20. Referentie vrije TFM wordt bereikt door de veronderstelling dat de ontspannen toestand voor elke fiducial marker kan worden voorspeld op basis van hoe markerings posities werden voorgeschreven tijdens het fabricageproces. Deze methoden maken het mogelijk om de spanningstoestand van een cel volledig vast te leggen binnen één beeldopname waarbij fiducial-markerings verplaatsingen worden gemeten in vergelijking met een impliciete verwijzing dan kan worden afgeleid uit de fiducial marker geometrie. Hoewel consistentie in marker plaatsing meestal wordt bereikt met behulp van deze platforms, hebben ze over het algemeen te kampen met hun eigen tekortkomingen ten opzichte van de veelgebruikte op kraal gebaseerde benaderingen, waaronder: 1) verminderde tractie resolutie; 2) verminderde nauwkeurigheid van verplaatsingen buiten het vliegtuig (in sommige gevallen een volledig onvermogen om te meten); en 3) verminderde aanpasbaarheid van platform substraten en materialen (bijv. ligand presentatie, mechanische eigenschappen).
Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een nieuw referentie vrij TFM-platform ontworpen. Het platform gebruikt multiphoton geactiveerde chemie om een klein volume van een de te crosslinken naar specifieke 3D-locaties binnen de hydrogel die dienen als fiducial markers om materiaal belasting te meten. Op deze manier hebben we een platform ontworpen dat vergelijkbaar is met kraal-gebaseerde benaderingen, maar met het aanzienlijke voordeel dat fiducial markers zijn georganiseerd in gerafeld arrays, waardoor referentie vrije materiaal strain tracking mogelijk is. Deze referentie vrije woning biedt vele voordelen. Eerst en vooral, het zorgt voor niet-opdringerige monitoring van cellulaire tractie toestanden (d.w.z., omzeilt de noodzaak om te ontspannen of cellen te verwijderen om referentie posities van ontheemde fiducial markers verwerven). Dit was ons primaire doel bij het ontwerpen van dit systeem, omdat we van plan waren om andere downstream analytische methoden in combinatie met TFM op te nemen, wat moeilijk kan zijn met destructieve end-point TFM-benaderingen. Ten tweede maakt het gebruik van een impliciete verwijzing op basis van gerafeerd arrays een near-complete automatisering van verplaatsings analyse mogelijk. De regelmatigheid van de arrays creëert een voorspelbare workflow waarbij het optreden van uitzonderlijke gevallen (d.w.z. voorbeeld celgegevens met onverwachte artefacten zoals suboptimale markerings afstand of registratie-mismatches) minimaal kan worden gehandhaafd. Ten derde biedt het afzien van de noodzaak om een referentiebeeld te verwerven de vrijheid om veel cellen op een enkel monster gedurende langere tijd te bewaken. Dit contrasteert met traditionele op kraal gebaseerde benaderingen, waarbij, afhankelijk van de betrouwbaarheid van de geautomatiseerde fase bewegingen van de Microscoop, fouten in positionering zich kunnen ophopen en de moeilijkheid van het correct registreren van referentiebeelden naar celspanning vergroten Afbeeldingen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit platform een hogere doorvoer bij het verzamelen van cellulaire spanningsgegevens.
Met dit protocol hopen we de lezers vertrouwd te maken met de Two-photon, laser scanning lithografie techniek die we hebben geïmplementeerd om dit referentie vrije TFM-platform te genereren voor het meten van in-plane en out-of-Plane tractie componenten gegenereerd door cellen die zijn geseerd op het oppervlak. Niet gedekt in dit protocol is de synthese van enkele van de monomere componenten. In het algemeen, deze reacties omvatten bijna identieke “One-pot” synthese reactieschema’s beschreven eerder21, en alternatieven voor deze producten kunnen ook worden gekocht. We streven er ook naar om lezers vertrouwd te maken met de softwaregebaseerde hulpmiddelen die we hebben gegenereerd om het gebruik van commercieel verkrijgbare laserscanmicroscopen als 3D-afdruk hulpmiddelen te bevorderen en om de analyse van fiducial-markerings verplaatsingen te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is om een workflow te bieden die veel van de problemen die gepaard gaan met het genereren en analyseren van TFM-gegevens verlicht. Eenmaal voorbereid zijn de photopatterned hydrogels eenvoudig te gebruiken, waarbij alleen kennis van standaard weefselkweek praktijken en fluorescentiemicroscopie vereist is. Het referentie vrije aspect maakt onbezorgd navigeren op hydrogels met cel beladen mogelijk en elimineert omslachtige beeldverwerkings stappen zoals beeldregistratie tussen referentie-en vervor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O. A. Banda werd gesteund door de financiering van een NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), opstart fondsen van de Universiteit van Delaware en het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS wordt ondersteund door de financiering van het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) en het National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). De toegang tot microscopie werd ondersteund door subsidies van de NIH-NIGMS (P20 GM103446), de NSF (IIA-1301765) en de staat Delaware. De gestructureerde verlichtings Microscoop werd verworven met fondsen van de staat van Delaware Federal Research and Development subsidieprogramma (16A00471). De LSM880 confocale Microscoop gebruikt voor Two-photon laser scanning lithografie werd verworven met een gedeelde instrumentatie subsidie (S10 OD016361).
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
References
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
- Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103 (2015).
- Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
- Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
- Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
- Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).
- Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
- Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
- Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
- Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
- Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
- Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
- . Slater Lab Code Repositories Available from: https://github.com/SlaterLab (2019)
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
- Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
- Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).
