Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para implementar litografía multifotópica para fabricar matrices tridimensionales de marcadores fiduciarios fluorescentes incrustados en hidrogeles basados en poli(etilenglicol) para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia y de tracción para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia Plataformas. Usando estas instrucciones, la medición de la tensión de material 3D y el cálculo de las tracciones celulares se simplificaparan para promover mediciones de fuerza de tracción de alto rendimiento.

Abstract

La cuantificación de la deformación del material inducida por células proporciona información útil sobre cómo las células detectan y responden a las propiedades físicas de su microambiente. Si bien existen muchos enfoques para medir la tensión de material inducida por las células, aquí proporcionamos una metodología para monitorear la tensión con resolución submicrones de una manera libre de referencia. Mediante un proceso de patrón fotolitográfico activado por dos fotones, demostramos cómo generar sustratos sintéticos mecánica y bioactivamente ajustables que contienen matrices incrustadas de marcadores fiduciarios fluorescentes para medir fácilmente tridimensionales ( 3D) perfiles de deformación del material en respuesta a las tracciones superficiales. Usando estos sustratos, los perfiles de tensión celular se pueden mapear usando una sola pila de imágenes 3D de una celda de interés. Nuestro objetivo con esta metodología es hacer de la microscopía de fuerza de tracción una herramienta más accesible y fácil de implementar para los investigadores que estudian los procesos de mecanotransducción celular, especialmente los recién llegados al campo.

Introduction

La microscopía de fuerza de tracción (TFM) es el proceso de aproximación de las tracciones celulares utilizando campos de desplazamiento interpolados de marcadores fiduciarios generados por una célula adherente y contráctil. Usando TFM, la influencia de las señales mecánicas en el entorno extracelular en procesos celulares importantes como la proliferación, diferenciación y migración se puede investigar^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Desafortunadamente, muchos enfoques existentes pueden ser difíciles de implementar o requieren familiaridad con herramientas analíticas y computacionales altamente especializadas, lo que dificulta el uso de TFM para investigadores inexpertos. Describimos una metodología para generar una plataforma TFM que elimina parte de la dificultad en el análisis al tiempo que proporciona una adquisición de datos de alto rendimiento.

De los enfoques de MFT existentes, el más comúnmente utilizado para cuantificar la tensión del material implica la incorporación de pequeños marcadores fluorescentes (típicamente cuentas fluorescentes del tamaño de nano o micrometro) en un hidrogel deformable, como la poliacrilamida (PAA) o la poli Diacrilato de etilenglicol (PEGDA)^13,14,15. Estos enfoques basados en cuentas proporcionan la capacidad de agrupar densamente marcadores fiduciarios alrededor de una celda de interés para maximizar el muestreo de desplazamiento. Desafortunadamente, la distribución de las cuentas a través del hidrogel no se puede controlar directamente por lo que la organización espacial es aleatoria. Esta colocación aleatoria conduce a problemas tales como perlas que están demasiado cerca unas de otras para resolver con precisión, o así se extienden que los parches del sustrato producen datos de baja calidad. La incapacidad de predecir dónde se encuentran los marcadores fiduciarios en ausencia de celdas también crea una restricción que, para cada conjunto recopilado de datos de tracción de celda, también se debe capturar una imagen de referencia adicional de los marcadores subyacentes en un estado relajado. La imagen de referencia es necesaria para que el desplazamiento en la imagen estresada se pueda aproximar como la diferencia entre las imágenes estresadas y no estresadas. Para lograr un estado relajado, las células que se miden se relajan químicamente o se eliminan por completo. Este proceso a menudo impide la adquisición de mediciones experimentales adicionales, inhibe los estudios celulares a largo plazo y limita el rendimiento. Una imagen de referencia también requiere técnicas de registro de imágenes para adaptarse a la deriva que puede haber ocurrido durante la experimentación, lo que a menudo conduce a una coincidencia manual engorrosa de imágenes de estado de tensión para hacer referencia a imágenes.

Otros métodos de MFT considerados libres de referencias, implementan algún tipo de control sobre la distribución de marcadores fiduciarios, ya sea por litografía de alta resolución, impresión de microcontactos o micromoldeo^{16,17,18 ,19,20}. El MFT libre de referencias se logra a través de la suposición de que el estado relajado para cada marcador fiduciario se puede predecir en función de cómo se prescribieron las posiciones de los marcadores durante el proceso de fabricación. Estos métodos permiten la captura completa del estado de tensión de una celda dentro de una única captura de imagen en la que se miden los desplazamientos de marcadores fiduciarios en comparación con una referencia implícita que se puede deducir de la geometría del marcador fiduciario. Mientras que la consistencia en la colocación de marcadores se logra típicamente usando estas plataformas, generalmente sufren de sus propias deficiencias en relación con los enfoques ampliamente utilizados basados en cuentas incluyendo: 1) disminución de la resolución de tracción; 2) disminución de la precisión de los desplazamientos fuera del plano (en algunos casos una incapacidad total de medir); y 3) disminución de la personalización de sustratos y materiales de plataforma (por ejemplo, presentación de ligandos, propiedades mecánicas).

Para abordar estas deficiencias, diseñamos una nueva plataforma tofa de referencia libre de referencias. La plataforma utiliza química activada por multifotones para recruzar un pequeño volumen de un fluoróforo en ubicaciones 3D específicas dentro del hidrogel que sirven como marcadores fiduciarios para medir la tensión del material. De esta manera, hemos diseñado una plataforma que funciona de manera similar a los enfoques basados en perlas, pero con el beneficio significativo de que los marcadores fiduciarios se organizan en matrices cuadriculadas que permiten el seguimiento de deformación unitaria de material libre de referencias. Esta propiedad libre de referencias ofrece muchas ventajas. En primer lugar, permite la monitorización no intrusiva de los estados de tracción celular (es decir, elude la necesidad de relajar o eliminar células para adquirir posiciones de referencia de marcadores fiduciarios desplazados). Este era nuestro objetivo principal en el diseño de este sistema, ya que pretendíamos incorporar otros métodos analíticos posteriores en conjunto con TFM, que pueden ser difíciles con enfoques destructivos de TFM de punto final. En segundo lugar, el uso de una referencia implícita basada en matrices cuadriculadas permite una automatización casi completa del análisis de desplazamiento. La regularidad de las matrices crea un flujo de trabajo predecible donde la aparición de casos excepcionales (es decir, datos de celda de ejemplo que contienen artefactos imprevistos, como el espaciado de marcadores subóptimo socada o las discrepancias de registro) se pueden mantener como mínimo. En tercer lugar, la falta de adquirir una imagen de referencia proporciona la libertad de supervisar muchas celdas en una sola muestra durante largos períodos de tiempo. Esto contrasta con los enfoques tradicionales basados en perlas, donde, dependiendo de la fidelidad de los movimientos escénicos automatizados del microscopio, se pueden acumular errores en el posicionamiento y aumentar la dificultad de registrar correctamente las imágenes de referencia a la tensión celular Imágenes. En general, esta plataforma facilita un mayor rendimiento en la recopilación de datos de tensión celular.

Con este protocolo, esperamos familiarizar a los lectores con la técnica de litografía de escaneo láser de dos fotones que implementamos para generar esta plataforma TFM libre de referencias para medir los componentes de tracción dentro y fuera del plano generados por las células sembradas en la superficie. No se trata en este protocolo es la síntesis de algunos de los componentes monoméricos. En general, estas reacciones incluyen esquemas de reacción de síntesis casi idénticos “una olla” descritos anteriormente²¹, y alternativas a estos productos también se pueden comprar. También pretendemos familiarizar a los lectores con las herramientas basadas en software que generamos para promover el uso de microscopios de escaneo láser disponibles comercialmente como herramientas de impresión 3D y facilitar el análisis de desplazamientos de marcadores fiduciarios.

Protocol

1. Fotopolimerización de un hidrogel base PEGDA Reactivos de recolección Recoger el litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), 3,4 kDa de poli(etileno) diacrilato de glicol (PEGDA), pirrolidona de n-vinilo (NVP), AlexaFluor 488 etiquetado PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiquetado PEGDA (PEG-633) y péptido RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de sus respectivos congeladores y llevar cada uno a temperatura ambiente. En tubos de microcentrífuga ámbar separados, mida 3 mg d…

Representative Results

A lo largo del protocolo, hay una serie de puntos de control que proporcionan retroalimentación para evaluar la calidad del procedimiento de patrón. Para proporcionar información sobre cómo evaluar el progreso en cada uno de estos puntos de control, proporcionamos resultados representativos de un experimento real. Los resultados ponen de relieve la aplicación de este protocolo realizado en un hidrogel fotopatrón preparado para el análisis DeMF de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC). Los resu…

Discussion

El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo que alivie gran parte de la dificultad asociada con la generación y análisis de datos TFM. Una vez preparados, los hidrogeles fotopatrónidos son fáciles de usar, lo que requiere sólo el conocimiento de las prácticas estándar de cultivo de tejidos y la microscopía de fluorescencia. El aspecto libre de referencia permite la navegación despreocupada en hidrogeles cargados de células y elimina los engorrosos pasos de procesamiento de imágenes, como …

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.