Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы
Summary
Этот протокол содержит инструкции по внедрению мультифотонной литографии для изготовления трехмерных массивов флуоресцентных фидуциальных маркеров, встроенных в поли (этиленгликоль) на основе гидрогелей для использования в качестве эталонной, свободной от тяги, микроскопии силы тяги Платформ. Используя эти инструкции, измерение напряжения 3D-материала и расчет клеточных тягу упрощается для содействия измерениям силы тяги с высокой пропускной связью.
Abstract
Количественная деформация материала, вызванная клетками, дает полезную информацию о том, как клетки чувствуют и реагируют на физические свойства своей микросреды. Хотя существует много подходов для измерения клеточного штамма материала, здесь мы предоставляем методологию мониторинга штамма с суб-микроном резолюции в безсправочной манере. Используя двухфотонный активированный процесс фотолитографического узора, мы демонстрируем, как генерировать механически и биоактивно настраиваемые синтетические субстраты, содержащие встроенные массивы флуоресцентных фидуциальных маркеров, чтобы легко измерить трехмерные ( 3D) профили деформации материала в ответ на поверхностные тяги. Используя эти субстраты, профили натяжения ячеек можно отобразить с помощью одного 3D-изображения, стек ячейки интереса. Наша цель с этой методологией, чтобы сделать тяговую силовую микроскопию более доступным и легким для реализации инструмента для исследователей, изучающих процессы клеточного механотрансдукции, особенно новичков в этой области.
Introduction
Микроскопия силы тяги (TFM) процесс приближения клеточных тяг с использованием интерполированных полей смещения фидуциальных маркеров, генерируемых адептом и сократительной клеткой. Использование TFM, влияние механических сигналов в внеклеточной среде на важные клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференциация и миграция могут быть исследованы1,2,3,4 ,5,6,7,9,10,11,12. К сожалению, многие существующие подходы могут быть трудными для реализации или требуют знакомства с узкоспециализированными аналитическими и вычислительными инструментами, что затрудняет использование TFM неопытным исследователям. Мы описываем методологию создания платформы TFM, которая устраняет некоторые трудности в анализе, а также обеспечивает высокопроизводительные данные.
Из существующих подходов TFM, наиболее часто используемых для количественной нагрузки материала включает в себя включение небольших флуоресцентных маркеров (обычно нано- или микрометрового флуоресцентного бисера) в деформируемый гидрогель, такие как полиакриламид (PAA) или поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA)13,14,15. Эти подходы на основе бисера обеспечивают возможность плотно кластерного кластера фидуциальных маркеров вокруг ячейки, представляющие интерес для максимального смещения выборки. К сожалению, распространение бисера по всему гидрогелю не может быть непосредственно контролируется, поэтому пространственная организация является случайной. Это случайное размещение приводит к таким проблемам, как бусы, которые находятся слишком близко друг к другу, чтобы точно решить, или так распространения, что патчи субстрата дают низкое качество данных. Неспособность предсказать, где фидуциальные маркеры лежат в отсутствие клеток также создает ограничение, что для каждого собранного набора данных тяги клетки, дополнительное эталонное изображение основных маркеров в расслабленном состоянии также должны быть захвачены. Эталонное изображение необходимо для того, чтобы смещение в подчеркнутом изображении можно было приблизить как различие между подчеркнутыми и неподчеркнутыми изображениями. Для достижения расслабленного состояния, измеряемые клетки либо химически расслаблены, либо полностью удалены. Этот процесс часто препятствует приобретению дальнейших экспериментальных измерений, тормозит долгосрочные исследования клеток и ограничивает пропускную стоимость. Ссылка на изображение также требует методов регистрации изображений для размещения для дрейфа, которые могут иметь место во время экспериментов, часто приводит к громоздким ручное сопоставление изображений состояния стресса для ссылки изображений.
Другие методы TFM считается ссылка бесплатно, осуществлять ту или иную форму контроля над распределением фидуциальных маркеров, либо с высоким разрешением литографии, микроконтактной печати, или микромолдинг16,17,18 ,19,20. Безсправочный TFM достигается за счет предположения, что расслабленное состояние для каждого фидуциального маркера может быть предсказано на основе того, как маркер позиции были предписаны в процессе изготовления. Эти методы позволяют полностью зафиксировать состояние напряжения ячейки в пределах одного захвата изображения, в котором фидуциальные смещения маркера измеряются по сравнению с подразумеваемой ссылкой, чем можно сделать вывод из фидуциальной геометрии маркера. Хотя согласованность в размещении маркеров обычно достигается с помощью этих платформ, они, как правило, страдают от собственных недостатков по сравнению с широко используемыми подходами на основе биса, включая: 1) снижение разрешения тяги; 2) снижение точности перемещений вне плана (в некоторых случаях полная неспособность измерить); и 3) снижение настраиваемости субстратов и материалов платформы (например, презентация лиганда, механические свойства).
Для устранения этих недостатков мы разработали новую платформу TFM без справочных данных. Платформа использует мультифотонный активированный химию, чтобы перекрестно перекрестно небольшой объем фторофора в конкретные 3D места в гидрогеле, которые служат фидуциальными маркерами для измерения напряжения материала. Таким образом, мы разработали платформу, которая работает так же, как бис основе подходов, но со значительным преимуществом, что фидуциальные маркеры организованы в сетчатые массивы, позволяющие для ссылки свободной отслеживания штамма материала. Эта безсправочная собственность дает много преимуществ. В первую очередь, он позволяет неинтрузивный мониторинг клеточных состояний тяги (т.е. обойти необходимость расслабиться или удалить клетки для получения эталонных позиций смещенных фидуциальных маркеров). Это было нашей главной целью в разработке этой системы, поскольку мы намеревались включить другие аналитические методы вниз по течению в тандеме с TFM, что может быть трудно с разрушительными подходами ТФМ. Во-вторых, использование подразумеваемой ссылки, основанной на сетчатых массивах, позволяет практически полностью автоматизировать анализ смещения. Регулярность массивов создает предсказуемый рабочий процесс, в котором возникновение исключительных случаев (т.е. данные ячейки образца, содержащие непредвиденные артефакты, такие как неоптимальный интервал между маркером или несоответствия регистрации) могут быть сохранены как минимум. В-третьих, отсутствие необходимости получения эталонного изображения обеспечивает свободу мониторинга многих ячеек на одном образце в течение длительных периодов времени. Это контрастирует с традиционными подходами на основе биса, где, в зависимости от точности автоматизированных этапных движений микроскопа, ошибки в позиционировании могут накапливаться и увеличивать сложность правильной регистрации эталонных изображений на напряжение клеток Изображения. В целом, эта платформа облегчает более высокую пропускную связь в сборе данных о сотовой напряженности.
С помощью этого протокола, мы надеемся ознакомить читателей с двумя фотона, лазерное сканирование литографии техники, которые мы реализовали для создания этой эталонной платформы TFM для измерения в плоскости и вне плоскости тяги компонентов, генерируемых клетками посеяны на поверхности. Не охваченный в этом протоколе синтез некоторых мономерных компонентов. В целом, эти реакции включают почти идентичные “один горшок” синтеза схемы реакции, описанные ранее21, и альтернативы этим продуктам также могут быть приобретены. Мы также стремимся ознакомить читателей с программными средствами, которые мы создали для содействия использованию коммерчески доступных лазерных сканирующих микроскопов в качестве инструментов 3D-печати и для облегчения анализа фидуциальных смещений маркеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью этого протокола является предоставление рабочего процесса, который значительно облегчает трудности, связанные с генерацией и анализом данных TFM. После подготовки гидрогели с фотопаттерированными являются простыми в использовании, требующими только знания стандартных методов ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
О. А. Банда была поддержана финансированием из NSF IGERT SBE2 стипендий (1144726), запуск средств, предоставленных Университетом Штата Делавэр, и Национальные институты здравоохранения / Национальный институт рака ИМАТ программы (R21CA214299). JHS поддерживается за счет финансирования со стороны Национальных институтов здравоохранения / Национальный институт рака IMAT программы (R21CA214299) и Национальный научный фонд CAREER Award Program (1751797). Доступ к микроскопии был поддержан грантами NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) и штата Делавэр. Структурированный подсветка микроскоп был приобретен на средства из штата Делавэр Федеральной программы исследований и разработок Грант (16A00471). Конфокальный микроскоп LSM880, используемый для двухфотонного лазерного сканирования литографии, был приобретен с помощью общего приборного гранта (S10 OD016361).
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
References
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
- Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103 (2015).
- Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
- Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
- Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
- Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).
- Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
- Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
- Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
- Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
- Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
- Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
- . Slater Lab Code Repositories Available from: https://github.com/SlaterLab (2019)
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
- Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
- Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).
