Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Summary

Denne protokol indeholder instruktioner til implementering af multiphoton litografi til at fabrikere tredimensionelle arrays af fluorescerende fiducial markører indlejret i poly (ethylenglycol)-baserede silicagelrogeler til brug som reference-fri, trækkraft mikroskopi Platforme. Ved hjælp af disse instruktioner forenkles måling af 3D-materiale stamme og beregning af cellulære distraktionerne for at fremme målinger af trækkraft med høj gennemløb.

Abstract

Kvantificering af celle induceret materiale deformation giver nyttige oplysninger om, hvordan cellerne fornemmer og reagerer på de fysiske egenskaber i deres mikromiljø. Mens mange tilgange findes til måling af celle-induceret materiale stamme, her giver vi en metode til overvågning af stamme med sub-micron opløsning på en reference-fri måde. Ved hjælp af en to-foton aktiveret photolithographic mønster proces, viser vi, hvordan man genererer mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske substrater, der indeholder indlejrede arrays af fluorescerende fiducial markører til nemt at måle tredimensionelle ( 3D) materiale deformation profiler som reaktion på overflade tractions. Ved hjælp af disse substrater kan celle spændings profiler tilknyttes ved hjælp af en enkelt 3D-billedstak af en celle af interesse. Vores mål med denne metode er at gøre Traction Force mikroskopi en mere tilgængelig og lettere at implementere værktøj til forskere, der studerer cellulære mekanisotransduktionsprocesser, især nytilkomne til marken.

Introduction

Trækkraft mikroskopi (TFM) er processen med at tilnærme cellulære distraktionerne ved hjælp interpoleret forskydning felter af fiducial markører genereret af en vedhængende og kontraktile celle. Ved hjælp af TFM kan indflydelsen fra mekaniske signaler i det ekstracellulære miljø på vigtige cellulære processer såsom spredning, differentiering og migration undersøges^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Desværre kan mange eksisterende tilgange være vanskelige at gennemføre eller kræve kendskab til højt specialiserede analytiske og beregningsmæssige værktøjer gør TFM vanskeligt for uerfarne forskere til at bruge. Vi beskriver en metode til at generere en TFM platform, der eliminerer nogle af de vanskeligheder i analysen, samtidig med at høj gennemløb dataindsamling.

Af de eksisterende TFM-tilgange omfatter de hyppigst anvendte til kvantificering af materiale stammen inkorporering af små fluorescerende markører (typisk fluorescerende perler i nano-eller mikrometer størrelse) i en deformerbar hydrogel, såsom polyacrylamid (PAA) eller poly (ethylenglycol) diacrylat (pegda)^13,14,15. Disse perle baserede tilgange giver mulighed for tæt klynge fiducial markører omkring en celle af interesse for at maksimere forskydning prøveudtagning. Desværre kan fordelingen af perlerne i hele hydrogel ikke styres direkte, så den rumlige organisation er tilfældig. Denne tilfældige placering fører til problemer såsom perler, der er for tæt på hinanden til præcist at løse, eller så sprede, at patches af substrat udbytte lav kvalitet data. Den manglende evne til at forudsige, hvor fiducial markører ligger i fravær af celler også skaber en begrænsning, at for hver indsamlede sæt af celle trækkraft data, en yderligere referencebillede af de underliggende markører i en afslappet tilstand skal også tages til fange. Referencebilledet er påkrævet, så forskydningen i det stressede billede kan tilnærses som forskellen mellem de stressede og ustressede billeder. For at opnå en afslappet tilstand, de celler, der måles, er enten kemisk afslappet eller helt fjernet. Denne proces forhindrer ofte erhvervelse af yderligere eksperimentelle målinger, hæmmer langsigtede celle undersøgelser, og begrænser gennemløb. En referencebillede kræver også billedregistrering teknikker til at rumme for drift, som kan have fundet sted under eksperimenter, ofte fører til besværlig manuel matchning af stress tilstand billeder til reference billeder.

Andre TFM-metoder, som anses for reference frie, gennemfører en eller anden form for kontrol over fordelingen af fiducial markører, enten ved højopløsnings litografi, mikrokontakttrykning eller mikromolding^{16,17,18 ,19,20}. Den reference frie TFM opnås ved at antage, at den afslappede tilstand for hver fiducial markør kan forudsiges ud fra, hvordan markør positioner blev ordineret under fremstillingsprocessen. Disse metoder giver mulighed for fuldstændig opsamling af en celles spændingstilstand inden for et enkelt billede, hvor fiducial markør forskydninger måles i forhold til en implicit reference, end der kan udledes af den fiducial markør geometri. Selv om konsistens i markørplacering typisk opnås ved hjælp af disse platforme, lider de generelt af deres egne mangler i forhold til de udbredte perle baserede tilgange, herunder: 1) nedsat trækkraft opløsning; 2) nedsat nøjagtighed af out-of-plane forskydninger (i nogle tilfælde en fuldstændig manglende evne til at måle); og 3) nedsat customizability af platform substrater og materialer (f. eks. ligand præsentation, mekaniske egenskaber).

For at afhjælpe disse mangler designede vi en ny reference-fri TFM-platform. Platformen udnytter multiphoton aktiveret kemi til at link en lille volumen af en fluoroforet i specifikke 3D steder inden for hydrogel, der tjener som fiducial markører til at måle materiale stamme. På denne måde har vi designet en platform, der fungerer på samme måde som Bead-baserede tilgange, men med den betydelige fordel, at fiducial markører er organiseret i gridded arrays giver mulighed for reference-fri materiale stamme tracking. Denne reference-fri ejendom giver mange fordele. Først og fremmest, det giver mulighed for ikke-påtrængende overvågning af cellulære trækkraft stater (dvs., omgår behovet for at slappe af eller fjerne celler til at erhverve referencepositioner af fordrevne fiducial markører). Dette var vores primære mål i udformningen af dette system, da vi havde til hensigt at indarbejde andre downstream analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskeligt med destruktive end-punkt TFM tilgange. For det andet, ved hjælp af en implicit reference baseret på gridded arrays giver mulighed for nær-komplet automatisering af fortrængnings analyse. Den formelle rigtighed af arrays skaber en forudsigelig arbejdsgang, hvor forekomsten af ekstraordinære tilfælde (dvs. prøve celledata, der indeholder uventede artefakter såsom suboptimal markør afstand eller registrering mismatch) kan opretholdes på et minimum. For det tredje giver afkald på behovet for at erhverve et referencebillede frihed til at overvåge mange celler på en enkelt prøve over længere tidsperioder. Dette står i kontrast til traditionelle perle baserede tilgange, hvor fejl i positionering kan akkumulere og øge vanskeligheden ved korrekt registrering af reference billeder til celle spændinger, afhængigt af hvordan mikroskopet er i automatiseret fase bevægelser. Billeder. Samlet set, denne platform letter højere gennemløb i indsamling cellulære spænding data.

Med denne protokol, vi håber at gøre læserne med de to-foton, Laserscanning litografi teknik, som vi implementeret for at generere denne reference-fri TFM platform til at måle in-plane og out-of-plane trækkraft komponenter genereret af celler seedet på overfladen. Ikke omfattet af denne protokol er syntesen af nogle af de monomeriske komponenter. Generelt omfatter disse reaktioner næsten identiske “One-pot”-syntese reaktions ordninger, der er beskrevet tidligere²¹, og alternativer til disse produkter kan også købes. Vi sigter også mod at gøre læserne bekendt med de softwarebaserede værktøjer, vi har genereret for at fremme brugen af kommercielt tilgængelige laser scannings mikroskoper som 3D-udskrivnings værktøjer og for at lette analysen af de fiducial markør forskydninger.

Protocol

1. photopolymerizing en PEGDA base hydrogel Indsamling af reagenser Indsamle lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforat (LAP), 3,4 kDa poly (ethylen) glykol diacrylat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mærket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mærket PEGDA (PEG-633) og pegyleret RGDS peptid ( Eller PEG-RGD’ER) fra deres respektive frysere og Bring hver til stuetemperatur. I separate rav-mikrocentrifuge glas måles 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 …

Representative Results

I hele protokollen er der en række kontrolpunkter, som giver feedback til at vurdere kvaliteten af mønstret procedure. For at give en vis indsigt i, hvordan man vurderer fremskridtene på hvert af disse checkpoints, giver vi repræsentative resultater af et egentligt eksperiment. Resultaterne fremhæver anvendelsen af denne protokol udført på en photopatterhydrogel, der er forberedt til TFM-analyse af humane navle vene endotheliale celler (Huvec’er). Resultaterne omfatter rå billeddata samt forarbejdede data udgange…

Discussion

Målet med denne protokol er at tilvejebringe en arbejdsgang, der letter en stor mængde af vanskelighederne i forbindelse med generering og analyse af TFM-data. Når de er tilberedt, er de photopatterned silicagelrogeler enkle at bruge, kræver kun viden om standard vævskultur praksis og Fluorescens mikroskopi. Det referencefri aspekt muliggør ubekymret navigation på celle belastede silicagelrogeler og eliminerer besværlige billedbehandlings trin såsom billedregistrering mellem reference og deformerede billeder. De…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.