एक संदर्भ मुक्त ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्म का निर्माण और कार्यान्वयन
Summary
इस प्रोटोकॉल बहुप्रकाशन लिथोग्राफी को लागू करने के लिए निर्देश प्रदान करता है फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के तीन आयामी सरणियों बनाने के लिए पाली में एम्बेडेड (एथिलीन ग्लाइकोल)-आधारित hydrogels संदर्भ मुक्त के रूप में उपयोग के लिए, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों. इन निर्देशों का उपयोग करना, 3 डी सामग्री तनाव और सेलुलर कर्षण की गणना की माप उच्च थ्रूपुट कर्षण बल माप को बढ़ावा देने के लिए सरल है.
Abstract
मात्राकारी सेल प्रेरित सामग्री विरूपण कैसे कोशिकाओं भावना और उनके microenvironment के भौतिक गुणों के लिए प्रतिक्रिया के विषय में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है. जबकि कई दृष्टिकोण सेल प्रेरित सामग्री तनाव को मापने के लिए मौजूद हैं, यहाँ हम एक संदर्भ मुक्त तरीके से उप माइक्रोन संकल्प के साथ तनाव की निगरानी के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं. एक दो-फोटोसक्रिय photolithographic पैटर्न प्रक्रिया का उपयोग करना, हम आसानी से तीन आयामी को मापने के लिए फ्लोरोसेंट fiducial मार्करों के एम्बेडेड सरणियों युक्त यंत्रवत् और जैव सक्रिय टूनाबल सिंथेटिक substrates उत्पन्न करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं ( 3 डी) सतह कर्षण के जवाब में सामग्री विरूपण प्रोफाइल. इन substrates का उपयोग करना, सेल तनाव प्रोफाइल ब्याज की एक सेल के एक एकल 3 डी छवि ढेर का उपयोग कर मैप किया जा सकता है. इस पद्धति के साथ हमारा लक्ष्य कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को सेलुलर mechanotransduction प्रक्रियाओं, विशेष रूप से क्षेत्र के लिए नए चेहरे का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपकरण को लागू करने के लिए एक और अधिक सुलभ और आसान बनाने के लिए है।
Introduction
ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक अनुशीलक और संकुचनशील सेल द्वारा उत्पन्न परिद्युद्योगिक मार्करों के अंतर्विष्ट विस्थापन क्षेत्रों का उपयोग करके लगभग सेलुलर कर्षणों की प्रक्रिया है। TFM का उपयोग करना, इस तरह के प्रसार के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं पर extracellular वातावरण में यांत्रिक संकेतों के प्रभाव, भेदभाव, और प्रवास की जांच की जा सकती1,2,3,4 5,6,7,8,9,10,11,12. दुर्भाग्य से, कई मौजूदा दृष्टिकोण को लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है या अत्यधिक विशेष विश्लेषणात्मक और कम्प्यूटेशनल उपकरण TFM का उपयोग करने के लिए मुश्किल बनाने के साथ परिचित की आवश्यकता होती है. हम एक TFM मंच है कि विश्लेषण में कठिनाई के कुछ समाप्त जबकि भी उच्च throughput डेटा अधिग्रहण प्रदान उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन.
मौजूदा टीएफएम दृष्टिकोणों में, सामग्री तनाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला सबसे अधिक छोटे फ्लोरोसेंट मार्कर (आमतौर पर नैनो- या माइक्रोमीटर-आकार के फ्लोरोसेंट मोती) को एक विरूपक हाइड्रोजेल में शामिल करना शामिल है, जैसे पॉलीऐक्रिलमाइड (पीएए) या पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) डायक्रिलेट (PEGDA)13,14,15. इन मनका आधारित दृष्टिकोण विस्थापन नमूना को अधिकतम करने के लिए ब्याज की एक सेल के आसपास घने क्लस्टर fiducial मार्करों करने की क्षमता प्रदान करते हैं. दुर्भाग्य से, hydrogel भर में मोती के वितरण सीधे नियंत्रित नहीं किया जा सकता है तो स्थानिक संगठन यादृच्छिक है. इस यादृच्छिक प्लेसमेंट ऐसे मोती जो भी सही ढंग से हल करने के लिए एक दूसरे के करीब हैं, या तो सब्सट्रेट उपज कम गुणवत्ता डेटा के पैच फैल के रूप में समस्याओं की ओर जाता है. भविष्यवाणी करने में असमर्थता जहां fiducial मार्करों कोशिकाओं की अनुपस्थिति में झूठ भी एक बाधा है कि, सेल कर्षण डेटा के हर एकत्र सेट के लिए, एक आराम राज्य में अंतर्निहित मार्करों के एक अतिरिक्त संदर्भ छवि भी कब्जा कर लिया जाना चाहिए बनाता है. संदर्भ प्रतिबिंब की आवश्यकता है ताकि तनावग्रस्त प्रतिबिंब में विस्थापन का अनुमान बल दिया गया और तनावग्रस्त छवियों के बीच के अंतर के रूप में अनुमानित किया जा सके। एक आराम राज्य को प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को मापा जा रहा है या तो रासायनिक आराम कर रहे हैं या पूरी तरह से हटा दिया. इस प्रक्रिया को अक्सर आगे प्रयोगात्मक माप के अधिग्रहण से बचाता है, लंबी अवधि के सेल अध्ययन रोकता है, और सीमा प्रवाह. एक संदर्भ छवि भी छवि पंजीकरण तकनीक बहाव जो प्रयोग के दौरान हुई हो सकता है के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है, अक्सर संदर्भ छवियों के लिए तनाव राज्य छवियों के बोझिल मैनुअल मिलान करने के लिए अग्रणी.
अन्य TFM तरीकों संदर्भ मुक्त समझा, fiducial मार्करों के वितरण पर नियंत्रण के कुछ फार्म को लागू, या तो उच्च संकल्प लिथोग्राफी, microcontact मुद्रण, या micromolding16,17,18 द्वारा ,19,20. संदर्भ मुक्त TFM धारणा है कि प्रत्येक fiducial मार्कर के लिए आराम राज्य कैसे मार्कर पदों निर्माण प्रक्रिया के दौरान निर्धारित किया गया था के आधार पर भविष्यवाणी की जा सकती है के माध्यम से प्राप्त की है. इन तरीकों में एक एकल छवि पर कब्जा है जिसमें fiducial मार्कर विस्थापन एक निहित संदर्भ की तुलना में से fiducial मार्कर ज्यामिति से अनुमान लगाया जा सकता है की तुलना में मापा जाता है के भीतर एक सेल के तनाव राज्य का पूरा कब्जा करने के लिए अनुमति देते हैं. मार्कर प्लेसमेंट में स्थिरता आम तौर पर इन प्लेटफार्मों का उपयोग कर हासिल की है, वे आम तौर पर सहित व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मनका आधारित दृष्टिकोण के सापेक्ष अपनी कमियों से पीड़ित हैं: 1) कर्षण संकल्प में कमी आई; 2) बाहर के विमान विस्थापन की सटीकता में कमी आई (कुछ मामलों में मापने के लिए एक पूरी असमर्थता); और 3) मंच substrates और सामग्री (उदा., लिगंड प्रस्तुति, यांत्रिक गुण) की customizability में कमी आई।
इन कमियों को दूर करने के लिए, हमने एक नया संदर्भ-मुक्त टीएफएम मंच तैयार किया है। मंच hydrogel के भीतर विशिष्ट 3 डी स्थानों में एक फ्लोरोफोर की एक छोटी सी मात्रा crosslink करने के लिए multiphoton सक्रिय रसायन विज्ञान का इस्तेमाल करता है कि भौतिक तनाव को मापने के लिए fiducial मार्करों के रूप में सेवा. इस तरह, हम एक मंच है कि इसी तरह संचालित करने के लिए मनका आधारित दृष्टिकोण है, लेकिन महत्वपूर्ण लाभ है कि fiducial मार्करों संदर्भ मुक्त सामग्री तनाव ट्रैकिंग के लिए अनुमति grided सरणियों में आयोजित कर रहे हैं के साथ डिजाइन किया है. यह संदर्भ मुक्त संपत्ति कई फायदे वहन करती है। और सबसे पहले, यह सेलुलर कर्षण राज्यों के गैर दखल देने वाली निगरानी के लिए अनुमति देता है (यानी, आराम करने के लिए या कोशिकाओं को हटाने के लिए विस्थापित fiducial मार्करों के संदर्भ पदों प्राप्त करने की आवश्यकता को दरकिनार). यह इस प्रणाली को डिजाइन करने में हमारा प्राथमिक लक्ष्य था, जैसा कि हम TFM, जो विनाशकारी अंत बिंदु TFM दृष्टिकोण के साथ मुश्किल हो सकता है के साथ मिलकर अन्य बहाव विश्लेषणात्मक तरीकों को शामिल करने का इरादा. दूसरा, gridded सरणियों पर आधारित एक निहित संदर्भ का उपयोग विस्थापन विश्लेषण के लगभग पूरा स्वचालन के लिए अनुमति देता है. सरणियों की नियमितता एक उम्मीद के मुताबिक कार्यप्रवाह बनाता है जहां असाधारण मामलों की घटना (यानी, नमूना सेल डेटा जिसमें अप्रत्याशित कलाकृतियों जैसे suboptimal मार्कर रिक्ति या पंजीकरण बेमेल) को कम से कम बनाए रखा जा सकता है। तीसरा, एक संदर्भ छवि प्राप्त करने की आवश्यकता के लिए जा रहा समय की विस्तारित अवधि में एक ही नमूने पर कई कोशिकाओं की निगरानी करने की स्वतंत्रता प्रदान करता है. पारंपरिक मनका आधारित दृष्टिकोण है, जहां, माइक्रोस्कोप के स्वचालित मंच आंदोलनों की निष्ठा पर निर्भर करता है के साथ यह विरोधाभास, स्थिति में त्रुटियों जमा और सेल तनाव के लिए ठीक से संदर्भ छवियों के पंजीकरण की कठिनाई में वृद्धि कर सकते हैं छवियां. कुल मिलाकर, इस मंच सेलुलर तनाव डेटा इकट्ठा करने में उच्च थ्रूपुट की सुविधा.
इस प्रोटोकॉल के साथ, हम दो फोटो, लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी तकनीक है कि हम इस संदर्भ मुक्त TFM मंच को मापने के लिए लागू के साथ पाठकों को परिचित करने की उम्मीद है विमान और बाहर के विमान कर्षण घटकों कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बीज सतह पर. इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं एकामंडलिक घटकों में से कुछ का संश्लेषण है. सामान्य में, इन प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं लगभग समान “एक पॉट” संश्लेषण प्रतिक्रिया योजनाओं पहले वर्णित21, और इन उत्पादों के लिए विकल्प भी खरीदा जा सकता है. हम भी सॉफ्टवेयर आधारित उपकरण हम 3 डी मुद्रण उपकरण के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए और fiducial मार्कर विस्थापन के विश्लेषण की सुविधा के लिए उत्पन्न के साथ पाठकों को परिचित करना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक कार्यप्रवाह है कि पीढ़ी और TFM डेटा के विश्लेषण के साथ जुड़े कठिनाई के बहुत कम प्रदान करना है. एक बार तैयार, photopatterned hydrogels का उपयोग करने के लिए सरल कर रहे हैं, मानक ऊतक संस्कृति प्रथाओं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ओ. बांदा को एनएसएफ आईजीईआरटी एसबीई2 फेलोशिप (1144726), डेलावेयर विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्टअप फंड और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/राष्ट्रीय कैंसर संस्थान आईएमएटी कार्यक्रम (आर21सीए214299) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। JHS स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान IMAT कार्यक्रम (R21CA214299) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार कार्यक्रम (1751797). माइक्रोस्कोपी का उपयोग NIH-NIGMS (P20 GM103446), एनएसएफ (IIA-1301765) और डेलावेयर के राज्य से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप डेलावेयर संघीय अनुसंधान और विकास अनुदान कार्यक्रम (16A00471) के राज्य से धन के साथ अधिग्रहण किया गया था. दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग लिथोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया LSM880 confocal माइक्रोस्कोप एक साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान (S10 OD016361) के साथ अधिग्रहण किया गया था।
Materials
| Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
| Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
| Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
| Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
| LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
| Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
| Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
| Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
| UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |
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