Fabrikasjon og implementering av en referanse-fri traction Force mikroskopi plattform

Summary

Denne protokollen gir instruksjoner for gjennomføring multiphoton litografi å dikte tredimensjonale arrays av fluorescerende fiducial markører innebygd i Poly (etylen glykol)-basert hydrogeler for bruk som referanse-fri, traction Force mikroskopi Plattformer. Ved hjelp av disse instruksjonene, måling av 3D-materiale belastning og beregning av cellulære tractions er forenklet for å fremme høy gjennomstrømming traction Force målinger.

Abstract

Kvantifisere celle-indusert materiale deformasjon gir nyttig informasjon om hvordan cellene forstand og svare på de fysiske egenskapene til deres mikromiljøet. Mens mange tilnærminger finnes for å måle celle-indusert materiale belastning, her gir vi en metodikk for overvåking stamme med sub-mikron oppløsning i en referanse-fri måte. Ved hjelp av en to-Foton aktivert photolithographic mønstre prosess, viser vi hvordan å generere mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske underlag som inneholder innebygde arrays av fluorescerende fiducial markører for enkelt å måle tredimensjonale ( 3D) materiale deformasjon profiler som svar på overflaten tractions. Ved hjelp av disse underlag, kan celle spennings profiler tilordnes ved hjelp av et enkelt 3D-bilde stabel av en celle av interesse. Vårt mål med denne metodikken er å gjøre traction Force mikroskopi en mer tilgjengelig og enklere å implementere verktøy for forskere som studerer cellulære mechanotransduction prosesser, spesielt nykommere til feltet.

Introduction

Traction Force mikroskopi (TFM) er prosessen med tilnærme mobilnettet tractions bruker interpolert forskyvning felt av fiducial markører generert av en tilhenger og kontraktile celle. Ved hjelp av TFM, påvirkning av mekaniske stikkordene i ekstracellulære miljø på viktige cellulære prosesser som spredning, differensiering, og migrasjon kan undersøkes^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Dessverre, mange eksisterende tilnærminger kan være vanskelig å gjennomføre eller krever kjennskap til høyt spesialiserte analytiske og beregningsorientert verktøy gjør TFM vanskelig for uerfarne forskere å bruke. Vi beskriver en metodikk for å generere en TFM-plattform som eliminerer noen av vanskelighetene i analysen, samtidig som det gir datainnhenting med høy gjennomstrømming.

Av de eksisterende TFM tilnærminger, den mest brukte for kvantifisere materielle belastningen innebærer inkorporering av små fluorescerende markører (vanligvis nano-eller mikrometer-sized fluorescerende perler) i en deformerbare hydrogel, for eksempel polyakrylamid (PAA) eller Poly (etylen glykol) diacrylate (PEGDA)^13,14,15. Disse perle-baserte tilnærminger gir muligheten til tett klynge fiducial markører rundt en celle av interesse for å maksimere forskyvning prøvetaking. Dessverre kan fordelingen av perlene i hele hydrogel ikke styres direkte, slik at den romlige organisasjonen er tilfeldig. Denne tilfeldige plassering fører til problemer som perler som er for nær hverandre for å nøyaktig løse, eller så spredt at flekker av underlaget gir lav kvalitet data. Manglende evne til å forutsi hvor fiducial markører ligger i fravær av celler skaper også en begrensning som, for hvert samlet sett av celle trekkraft data, en ekstra referanse bilde av de underliggende markører i en avslappet tilstand må også fanges. Referansen bildet er nødvendig slik at forskyvning i stresset bildet kan anslås som forskjellen mellom stresset og trykklette bilder. For å oppnå en avslappet tilstand, cellene som måles er enten kjemisk avslappet eller helt fjernet. Denne prosessen hindrer ofte anskaffelse av ytterligere eksperimentelle målinger, hemmer langsiktige celle studier, og begrenser gjennomstrømming. En referanse bildet krever også bilde registrering teknikker for å imøtekomme for drift som kan ha skjedd under eksperimentering, ofte fører til tungvint manuell Matching av stress tilstand bilder til referanse bilder.

Andre TFM metoder anses referanse-fri, implementere noen form for kontroll over fordelingen av fiducial markører, enten ved høy oppløsning litografi, microcontact utskrift, eller micromolding^{16,17,18 ,19,20}. Referanse-Free TFM oppnås gjennom antagelsen om at avslappet tilstand for hver fiducial markør kan anslås basert på hvordan markør posisjoner ble foreskrevet under fabrikasjon prosessen. Disse metodene gir mulighet for fullstendig fangst av en celle spennings tilstand innenfor et enkelt bilde fangst der fiducial markør forskyvninger måles i forhold til en underforstått referanse enn det som kan utledes fra fiducial markør geometri. Mens konsistens i markørplassering er vanligvis oppnås ved hjelp av disse plattformene, de vanligvis lider av sine egne svakheter i forhold til de mye brukte perle-baserte tilnærminger inkludert: 1) redusert trekkraft oppløsning; 2) redusert nøyaktigheten av ut-av-flyet forskyvninger (i noen tilfeller en fullstendig manglende evne til å måle); og 3) nedsatt customizability av plattform underlag og materialer (f.eks. ligand presentasjon, mekaniske egenskaper).

For å løse disse svakhetene, utviklet vi en ny referanse-fri TFM-plattform. Plattformen benytter multiphoton aktivert kjemi for å krysskobling et lite volum av en fluoroforen i bestemte 3D steder innenfor hydrogel som fungerer som fiducial markører for å måle materielle belastninger. På denne måten har vi designet en plattform som opererer på samme måte som perle-baserte tilnærminger, men med den betydelige fordelen at fiducial markører er organisert i gridded arrays slik at referanse-fri materiale belastning sporing. Dette referanse-fri eiendom gir mange fordeler. Først og fremst gir det for ikke-påtrengende overvåking av cellulære trekkraft tilstander (dvs. omgår behovet for å slappe av eller fjerne celler for å erverve referanse posisjoner av fordrevne fiducial markører). Dette var vårt primære mål i utformingen av dette systemet, som vi hadde til hensikt å innlemme andre nedstrøms analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskelig med destruktive endepunkt TFM tilnærminger. For det andre, ved hjelp av en underforstått referanse basert på gridded arrays tillater nesten komplett automatisering av forskyvning analyse. Den regularitet av arrays skaper en forutsigbar arbeidsflyt der forekomsten av eksepsjonelle tilfeller (dvs. eksempel celledata som inneholder uventede gjenstander som suboptimal markør avstand eller registrering uoverensstemmelser) kan opprettholdes på et minimum. For det tredje, avkall behovet for å erverve en referanse bilde gir frihet til å overvåke mange celler på en enkelt prøve over lengre perioder av gangen. Dette står i kontrast til tradisjonelle perle-baserte tilnærminger, der, avhengig av troskap til mikroskopet automatiserte etappe bevegelser, feil i posisjonering kan akkumulere og øke vanskeligheten av riktig å registrere referanse bilder til celle spenning Bilder. Overall, forenkler denne plattformen høyere gjennomstrømming i å samle mobilnettet spennings data.

Med denne protokollen, håper vi å bli kjent med leserne med to-Foton, laserskanning litografi teknikk som vi implementert for å generere denne referansen-fri TFM plattform for å måle i-fly og ut-av-flyet trekkraft komponenter generert av celler seeded på overflaten. Ikke dekket i denne protokollen er syntesen av noen av de monomere komponentene. Generelt, disse reaksjonene inkluderer nesten identiske “en-pott” syntese reaksjons ordninger beskrevet tidligere²¹, og alternativer til disse produktene kan også kjøpes. Vi har også som mål å gjøre leserne kjent med programvarebasert verktøy vi genererte for å fremme bruken av kommersielt tilgjengelige laser-skanning mikroskop som 3D-utskrift verktøy og for å lette analysen av fiducial markør forskyvninger.

Protocol

1. Photopolymerizing en PEGDA base hydrogel Samle reagenser Samle Lithium fenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3,4 kDa Poly (etylen) glykol diacrylate (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 merket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 merket PEGDA (PEG-633), og pegylert RGDS peptid ( PEG-RGDS) fra sine respektive frysere og bringe hver til romtemperatur. I separate rav mikrosentrifugen rør, måle 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, og 6 mg…

Representative Results

Gjennom hele protokollen er det en rekke sjekkpunkter som gir tilbakemelding for å vurdere kvaliteten på mønster prosedyren. For å gi innsikt om hvordan man vurderer fremdriften ved hvert av disse kontrollpunktene, gir vi representative resultater for et eksperiment. Resultatene markere anvendelsen av denne protokollen utført på en photopatterned hydrogel forberedt på TFM analyse av menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs). Resultatene inkluderer rå bildedata i tillegg til behandlede data utganger i hve…

Discussion

Målet med denne protokollen er å gi en arbeidsflyt som lindrer mye av vanskelighetene knyttet til generering og analyse av TFM data. Når forberedt, de photopatterned hydrogeler er enkle å bruke, som krever bare kjennskap til standard vev kultur praksis og fluorescens mikroskopi. Referansen-gratis aspekt muliggjør bekymringsløs navigering på celle-Laden hydrogeler og eliminerer tungvint bildebehandling trinn som bilde registrering mellom referanse og deformert bilder. Den resulterende analysen er nesten helt automa…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.