Tillverkning och implementering av en referens fri dragkrafts mikroskopi plattform

Summary

Detta protokoll innehåller instruktioner för att genomföra multiphoton litografi att tillverka tredimensionella matriser av fluorescerande relaterat markörer inbäddade i poly (etylenglykol)-baserade hydrogeler för användning som referens-fri, dragkraft mikroskopi Plattformar. Med hjälp av dessa instruktioner, är mätning av 3D-materialstam och beräkning av cellulära Tractions förenklad för att främja hög genomströmning dragkraft mätningar.

Abstract

Kvantifiering av cellinducerad material deformation ger användbar information om hur celler känner och reagerar på de fysikaliska egenskaperna hos deras mikromiljö. Medan många metoder finns för att mäta cell-inducerad material stam, här erbjuder vi en metod för övervakning stam med sub-micron upplösning på ett referensfritt sätt. Med hjälp av en två-Photon aktiverat photolithographic mönstra process, visar vi hur man genererar mekaniskt och biologiskt aktivt avstämbara syntetiska substrat som innehåller inbäddade arrayer av fluorescerande relaterat markörer för att enkelt mäta tredimensionell ( 3D) material deformationsprofiler som svar på yttractions. Med hjälp av dessa substrat kan cell spännings profiler mappas med en enda 3D-bildstapel i en cell av intresse. Vårt mål med denna metod är att göra dragkraft mikroskopi en mer tillgänglig och lättare att implementera verktyg för forskare som studerar cellulära mechanotransduction processer, särskilt nykomlingar på området.

Introduction

Traction Force mikroskopi (TFM) är processen att approximera cellulära Tractions med interpolerade förskjutnings fält av relaterat markörer som genereras av en anhängare och kontraktila cell. Med hjälp av TFM, påverkan av mekaniska signaler i den extracellulära miljön på viktiga cellulära processer såsom spridning, differentiering, och migration kan undersökas^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Tyvärr, många befintliga metoder kan vara svårt att genomföra eller kräva förtrogenhet med mycket specialiserade analytiska och Computational verktyg gör TFM svårt för oerfarna forskare att använda. Vi beskriver en metod för att skapa en TFM-plattform som eliminerar några av svårigheterna i analysen samtidigt som datainsamling med högt dataflöde.

Av de befintliga TFM-metoderna innebär den mest använda för kvantifiering av materialets belastning att små fluorescerande markörer (typiskt nano-eller mikrometerfluorescerande pärlor) införlivas i en deformerbar hydrogel, såsom polyakrylamid (PAA) eller Poly (etylenglykol) diakrylat (pegda)^13,14,15. Dessa pärla-baserade metoder ger möjlighet att tätt kluster relaterat markörer runt en cell av intresse för att maximera förskjutning provtagning. Tyvärr kan fördelningen av pärlorna i hela hydrogel inte direkt kontrolleras så att den rumsliga organisationen är slumpmässig. Denna slumpmässiga placering leder till problem som pärlor som är för nära varandra för att korrekt lösa, eller så sprids att fläckar av substratet ger låg kvalitet data. Oförmågan att förutsäga var relaterat markörer ligger i avsaknad av celler skapar också en begränsning som, för varje insamlade uppsättning av cell Traction data, en ytterligare referensbild av de underliggande markörer i ett avslappnat tillstånd måste också fångas. Referensbilden krävs så att förskjutningen i den stressade bilden kan approximeras som skillnaden mellan de stressade och ostressade bilderna. För att uppnå ett avslappnat tillstånd är de celler som mäts antingen kemiskt avslappnade eller helt borttagna. Denna process förhindrar ofta förvärv av ytterligare experimentella mätningar, hämmar långsiktiga cellstudier, och begränsar genomströmningen. En referensbild kräver också bild registrering tekniker för att rymma för drift som kan ha inträffat under experimenterande, ofta leder till besvärlig manuell matchning av stresstillstånd bilder till referensbilder.

Andra TFM metoder som anses vara referens fria, genomföra någon form av kontroll över fördelningen av relaterat markörer, antingen genom högupplöst litografi, microcontact utskrift, eller micromolding^{16,17,18 ,19,20}. Referens fria TFM uppnås genom antagandet att den avslappnade tillstånd för varje relaterat markör kan förutses baserat på hur markör positioner ordinerades under tillverkningsprocessen. Dessa metoder möjliggör fullständig avskiljning av en cells spänningstillstånd inom en enda bildfångst där relaterat markör förskjutningar mäts i jämförelse med en antydd referens än vad som kan härledas från den relaterat markör geometri. Medan konsistens i markör placering vanligtvis uppnås med hjälp av dessa plattformar, de i allmänhet lider av sina egna brister i förhållande till de allmänt använda pärla-baserade metoder inklusive: 1) minskad dragkraft upplösning; 2) minskad noggrannhet av out-of-Plane förskjutningar (i vissa fall en fullständig oförmåga att mäta); och 3) minskad anpassningsbarhet av plattforms substrat och material (t. ex. ligand-presentation, mekaniska egenskaper).

För att åtgärda dessa brister har vi utformat en ny referens fri TFM-plattform. Plattformen använder multiphoton aktiverad kemi för att korslänka en liten volym av en fluorophore till specifika 3D-platser inom hydrogel som fungerar som relaterat markörer för att mäta material stam. På detta sätt har vi utformat en plattform som fungerar på liknande sätt som pärlbaserade metoder men med den betydande fördelen att relaterat markörer är organiserade i inrutade matriser möjliggör referens-fri material stam spårning. Denna referens fria egenskap ger många fördelar. Först och främst gör det möjligt för icke-störande övervakning av cellulära Traction stater (dvs kringgår behovet av att slappna av eller ta bort celler för att förvärva referens positioner förskjutna relaterat markörer). Detta var vårt främsta mål i utformningen av detta system, som vi avsåg att införliva andra nedströms analytiska metoder i tandem med TFM, vilket kan vara svårt med destruktiva slutpunkt TFM metoder. För det andra, med hjälp av en implicit referens baserad på inrutade matriser möjliggör nästan komplett automatisering av förskjutnings analys. Regelbundenhet av matriser skapar ett förutsägbart arbetsflöde där förekomsten av exceptionella fall (dvs. exempel celldata som innehåller oförutsedda artefakter som suboptimala markör avstånd eller registrering missmatchningar) kan upprätthållas på ett minimum. För det tredje, att avstå från behovet av att förvärva en referensbild ger frihet att övervaka många celler på ett enda prov under längre tidsperioder. Detta kontrasterar mot traditionella pärlbaserade metoder, där, beroende på trohet av mikroskopet automatiserade steg rörelser, kan fel i positionering ackumuleras och öka svårigheten att korrekt registrera referensbilder till cellspänningar Bilder. Sammantaget underlättar denna plattform högre genomströmning för att samla in cellulära spännings data.

Med detta protokoll, vi hoppas att bekanta läsarna med två-Photon, laserskanning litografi teknik som vi genomfört för att generera denna referens-fri TFM plattform för att mäta in-plane och out-of-Plane dragkraft komponenter som genereras av celler seedade på ytan. Inte omfattas av detta protokoll är syntesen av några av de monomeriska komponenterna. I allmänhet, dessa reaktioner inkluderar nästan identiska “One-Pot” syntes reaktionsscheman beskrivs tidigare²¹, och alternativ till dessa produkter kan också köpas. Vi strävar också efter att bekanta läsarna med mjukvarubaserade verktyg vi genererade för att främja användningen av kommersiellt tillgängliga laser-scanning Mikroskop som 3D-utskriftsverktyg och för att underlätta analys av relaterat markör förskjutningar.

Protocol

1. photopolymerizing en PEGDA bas hydrogel Samla reagenser Samla in litiumfenyl-2, 4, 6-trimetylbensoylfoshinat (varv), 3,4 kDa poly (etylen) glykoldiakrylat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 märkt PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 märkta PEGDA (PEG-633) och pegylerat RGDS peptid ( PEG-RGDS) från sina respektive frysar och ta varje till rumstemperatur. I separata Amber microcentrifug rör, åtgärd 3 mg varv, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, och 6…

Representative Results

Under hela protokollet finns det ett antal kontrollpunkter som ger återkoppling för att bedöma kvaliteten på mönster förfarandet. För att ge viss insikt om hur man bedömer framstegen vid var och en av dessa kontrollpunkter, ger vi representativa resultat av ett faktiskt experiment. Resultaten belyser tillämpningen av detta protokoll som utförs på en fotomönstrad hydrogel beredd för TFM analys av mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs). Resultaten inkluderar RAW-bilddata samt bearbetade data utdata vid va…

Discussion

Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett arbetsflöde som lindrar en stor del av svårigheten i samband med generering och analys av TFM-data. När beredd, de fotomönstrade hydrogeler är enkla att använda, kräver endast kunskap om standard vävnad kultur praxis och fluorescens mikroskopi. Den referens fria aspekten möjliggör bekymmersfri navigering på celllastade hydrogeler och eliminerar besvärliga bild bearbetningssteg som bild registrering mellan referens och deformerade bilder. Den resulterande …

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.