In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem
Summary
Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.
Abstract
Het gebruik van primaire, normale epitheelcellen maakt het mogelijk om voor cellulaire transformatie genomische veranderingen te induceren door specifieke mutaties in oncogenen en tumor suppressor-genen te introduceren, met behulp van geclusterde regelgevende intergespreide korte palindroom herhaalde (CRISPR)-gebaseerde genoom bewerkingstechnologie in muizen. Deze technologie stelt ons in staat om de genetische veranderingen die zich voordoen bij menselijke kankers met muizen, nauwkeurig na te bootsen. Door het genetisch transformeren van muriene primaire cellen kunnen we de ontwikkeling van kanker, progressie, behandeling en diagnose beter bestuderen. In deze studie gebruikten we CRE-inducible Cas9 muizen tong epitheelcellen om genoom bewerking mogelijk te maken met behulp van adeno-geassocieerde virus (AAV) in vitro. Specifiek, door het veranderen van kras, p53, en APC in normale tong Epitheelcellen, we gegenereerd een Murine hoofd en nekkanker (HNC) cellijn in vitro, die tumorigene in syngene muizen. De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe HNC cellijnen te genereren met specifieke genomische veranderingen en verklaart hun geschiktheid voor het voorspellen van tumorprogressie in syngene muizen. We stellen voor dat deze veelbelovende methode informatief en nuttig zal zijn om de tumor biologie en de therapie van HNC te bestuderen.
Introduction
HNC is een gemeenschappelijke maligniteit wereldwijd1. Het modelleren van de Genesis van HNC neoplasie is momenteel op een wetenschappelijk draaipunt2. Hoewel veel genetische mutaties zijn geïdentificeerd in HNC2,3,4 (bijvoorbeeld TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 en RAS), zijn de specifieke combinaties van genomische aanpassingen die nodig zijn in het concert om HNC te induceren onduidelijk.
Het huidige gebruik van menselijke HNC cellijnen heeft aanzienlijk geholpen om de mechanismen in verband met pathogenese en behandeling3te verhelmaken. Echter, de studie van menselijke cellijnen in immuungecompromitteerde Murine systemen heeft zijn beperkingen, omdat deze systemen niet het in vivo neoplastische proces, de rol van specifieke genmutaties en behandeling reacties in een immuunmicroomgeving aanpakken. Vandaar dat de ontwikkeling en oprichting van muriene cellijnen met specifieke genetische veranderingen van primair belang zijn om te bestuderen hoe verschillende genen bijdragen aan het transformatieproces en om nieuwe op moleculen gebaseerde therapieën te testen in immunocompetente muizen.
Genfunctie studies in biomedisch onderzoek zijn significant beïnvloed door vooruitgang in DNA-bewerkings technologieën, door het introduceren van Double-strand Breaks (DSBs), bijvoorbeeld5. Deze technologieën, waaronder het gebruik van zink vinger nucleasen, transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen, en geclusterde regulatoire intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR/Cas9), maken het mogelijk om een gen van belang op zijn Locus te manipuleren. De laatste CRISPR/Cas9 systemen bestaan uit een RNA Guide (gRNA) die de Cas9 Nuclease leidt om een DSB op een specifieke plaats in het genoom te genereren. Dit systeem heeft uitgebreide erkenning gekregen in het wijzigen van endogene genen in een cel of doelweefsel, zelfs in de meest traditioneel moeilijk te behandelen organismen5. Het heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere systemen vanwege de eenvoud, snelheid en efficiëntie.
In oncologie heeft CRISPR/CAS9 technologie de noodzaak vervuld om kankercellen effectief te imiteren. Om dit systeem in HNC te vestigen, hebben we het potente kras-oncogen en twee belangrijke tumor suppressor genen, APC en p536gemanipuleerd. Volgens de GENIE database7, deze combinatie is zeldzaam in HNC. RAS-mutaties (HRI’S, NRI’S en KRAS) zijn aanwezig in slechts ~ 7% van alle HNC-populaties. Deze tumoren zijn meestal resistent tegen therapie8,9.
De levering van Cas9 en zijn gRNA wordt bereikt door middel van virale transductie met behulp van AAVs of lentivirussen. Recombinant AAV is vaak de voorkeursmethode voor het leveren van genen om cellen te targeten vanwege de hoge titer, milde immuunrespons, het vermogen om een breed scala aan cellen te leiden en de algehele veiligheid. Met behulp van een AAV-systeem zijn verschillende Weefselspecifieke cellijnen gegenereerd en worden er nog steeds nieuwe cellijnen ontwikkeld10,11,12. Echter, een efficiënte genomische editing systeem dat kan genereren Murine HNC cellijn modellen cellen nog moet worden ontwikkeld. In deze studie hebben we getracht een in vitro Aav-Cas9 gebaseerd systeem te ontwikkelen voor het transformeren van primaire muriene tong cellen in een tumorigene toestand. Dit unieke CRISPR/Cas9 transformatie protocol en de vastgestelde tumor cellijn kan worden gebruikt om de biologie van HNC geïnduceerd door een diversiteit van genomische veranderingen beter te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende methoden zijn eerder gebruikt om primaire cellen in cultuur te transformeren met variabele mate van succes25,26,27,28. De meeste van deze methoden gebruiken muis fibroblast cellen voor transformatie14,17,18,19 of gebruik carcinogenen zoals 4-nitroquinoli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Daniel Gitler bedanken voor het verstrekken van de pAd Delta 5 helper plasmide. Dit werk werd gefinancierd door de Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (voor mij), de Stichting voor Binational Science van de Verenigde Staten (BSF, 2017323) (voor mij en mevrouw), de Israëlisch Kankervereniging (ICA, 20170024) (voor mij), de Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (voor mij) en de Stichting zorg (#7895) (voor mij). Fellowship: de Alon Fellowship voor mij en BGU Kreitman beurzen naar SJ en MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
