In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno
Summary
El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.
Abstract
El uso de células epiteliales normales primarias permite inducir reproduciblemente las alteraciones genómicas necesarias para la transformación celular mediante la introducción de mutaciones específicas en oncogenes y genes supresores de tumores, utilizando tecnología de edición del genoma basada en repetición palindrómica corta (CRISPR) en ratones. Esta tecnología nos permite imitar con precisión los cambios genéticos que se producen en los cánceres humanos que utilizan ratones. Al transformar genéticamente las células primarias murinas, podemos estudiar mejor el desarrollo, la progresión, el tratamiento y el diagnóstico del cáncer. En este estudio, utilizamos células epiteliales de lengua de ratón Cas9 inducibles Cre 9 para permitir la edición del genoma utilizando virus asociado al adeno (AAV) in vitro. Específicamente, al alterar KRAS, p53 y APC en células epiteliales normales de la lengua, generamos una línea celular de cáncer de cabeza y cuello murino (HNC) in vitro, que es tumorigénica en ratones singéricos. El método presentado aquí describe en detalle cómo generar líneas celulares HNC con alteraciones genómicas específicas y explica su idoneidad para predecir la progresión del tumor en ratones singéricos. Prevemos que este método prometedor será informativo y útil para estudiar la biología tumoral y la terapia de HNC.
Introduction
La HNC es una neoplasia maligna común en todo el mundo1. El modelado de la génesis de la neoplasia HNC se encuentra actualmente en un punto de inflexión científico2. Si bien se han identificado muchas mutaciones genéticas en HNC2,3,4 (por ejemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 y RAS) las combinaciones específicas de alteraciones genómicas necesarias en concierto para inducir la HNC siguen sin estar claras.
El uso actual de líneas celulares HNC humanas ha ayudado significativamente a dilucidar los mecanismos asociados con la patogénesis y el tratamiento3. Sin embargo, el estudio de las líneas celulares humanas en sistemas murinos inmunocomprometidos tiene sus limitaciones, porque estos sistemas no abordan el proceso neoplásico in vivo, el papel de mutaciones genéticas específicas y las respuestas de tratamiento en un microambiente inmune. Por lo tanto, el desarrollo y establecimiento de líneas celulares murinas con alteraciones genéticas específicas son de importancia primordial para estudiar cómo los diferentes genes contribuyen al proceso de transformación y para probar nuevas terapias basadas en moléculas en ratones inmunocompetentes.
Los estudios de la función génica en la investigación biomédica se han visto significativamente afectados por los avances en las tecnologías de edición de ADN, mediante la introducción de roturas de doble cadena (DSB), por ejemplo5. Estas tecnologías, incluido el uso de nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción y las repeticiones palindrómicas cortas regulables agrupadas (CRISPR/Cas9), permiten la manipulación de cualquier gen de interés en su locus. Los últimos sistemas CRISPR/Cas9 se componen de un ARN guía (gRNA) que ordena a la nucleasa Cas9 que genere un OSD en un sitio específico del genoma. Este sistema ha ganado un amplio reconocimiento en la modificación de genes endógenos en cualquier célula o tejido diana, incluso en los organismos más tradicionalmente difíciles de tratar5. Tiene múltiples ventajas sobre otros sistemas debido a su simplicidad, velocidad y eficiencia.
En oncología, la tecnología CRISPR/CAS9 ha cumplido la necesidad de imitar eficazmente las células cancerosas. Para establecer este sistema en HNC, manipulamos el potente oncogén KRAS y dos genes supresores de tumores importantes, APC y p536. Según la base de datos GENIE7,esta combinación es rara en HNC. Las mutaciones de RAS (HRAS, NRAS y KRAS) están presentes en sólo el 7% de todas las poblaciones de HNC. Estos tumores tienden a ser resistentes a la terapia8,9.
La entrega de Cas9 y su ARNm se logra a través de la transducción viral utilizando AAVs o lentivirus. El AAV recombinante es a menudo el método preferido para la entrega de genes a las células diana debido a su alto títer, respuesta inmune leve, capacidad de transducción de una amplia gama de células, y seguridad general. Utilizando un sistema AAV, se han generado varias líneas celulares de ratón específicas del tejido, y todavía se están desarrollando nuevas líneas celulares10,11,12. Sin embargo, aún queda por desarrollar un sistema de edición genómica eficiente que pueda generar modelos de líneas celulares HNC murinos. En este estudio, buscamos desarrollar un sistema in vitro basado en AAV-Cas9 para transformar las células primarias de la lengua murina en un estado tumorigénico. Este protocolo único de transformación CRISPR/Cas9 y la línea celular tumoral establecida se pueden utilizar para comprender mejor la biología de la HNC inducida por una diversidad de alteraciones genómicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios métodos se han utilizado previamente para transformar células primarias en cultivo con grados variables de éxito25,26,27,28. La mayoría de estos métodos utilizan células de fibroblastos de ratón para la transformación14,17,18,19 o utilizan carcinógenos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer al Dr. Daniel Gitler por proporcionarnos el plásmido pAd Delta 5 Helper. Este trabajo fue financiado por la Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (a ME), la Fundación Binacional de Ciencias De Estados Unidos-Israel (BSF, 2017323) (a ME y MS), la Asociación Israelí contra el Cáncer (ICA, 20170024) (a ME), la Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (a ME) y la Concern Foundation (#7895) (a ME). Beca: la beca Alon a ME y BGU Kreitman becas a SJ y MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
