Summary
頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。
Abstract
原発性正常上皮細胞の使用により、細胞内遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に特異的な変異を導入することにより、細胞間のクラスタリング制御を用いて、細胞形質転換に必要なゲノム変化を再現的に誘導することが可能になる。マウスにおける短いパリンドロミック反復(CRISPR)ベースのゲノム編集技術。この技術により、マウスを用いてヒトがんに生じる遺伝的変化を正確に模倣することができます。マウスの一次細胞を遺伝子組み換えすることで、がんの発症、進行、治療、診断をより良く研究することができます。本研究では、クレ誘導性Cas9マウス舌上皮細胞を用いて、アデノ関連ウイルス(AAV)をインビトロでゲノム編集することを可能にした。具体的には、正常舌上皮細胞でKRAS、p53、APCを改変することにより、同系マウスの腫瘍性であるプリン頭頸部癌(HNC)細胞株をインビトロで生成した。ここで提示する方法は、特定のゲノム改変を有するHNC細胞株を生成する方法を詳細に説明し、同系マウスにおける腫瘍進行を予測するための適合性を説明する。我々は、この有望な方法がHNCの腫瘍生物学と治療を研究するのに有益かつ有用であろうことを想像する。
Introduction
HNCは世界的に一般的な悪性腫瘍である 1.HNC新生物の起源をモデル化することは、現在科学的転換点2にあります。HNC2、3、4(例えば、TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1、RAS)では多くの遺伝子変異が同定されているが、HNCを誘導するために協調して必要なゲノム改変の特異的な組み合わせは不明のままである。
ヒトHNC細胞株の現在の使用は、病因および治療3に関連するメカニズムを解明するのに有意に役立った。しかしながら、免疫不全マウス系におけるヒト細胞株の研究には限界があり、これらのシステムは生体内新生物プロセス、特定の遺伝子変異の役割、免疫微小環境における治療応答に対処しない。したがって、特定の遺伝子改変を伴うマウス細胞株の開発と確立は、異なる遺伝子が形質転換過程にどのように寄与するかを研究し、免疫能力マウスにおける新規分子ベースの治療法を試験するために最も重要である。
生物医学研究における遺伝子機能研究は、DNA編集技術の進歩によって、二本鎖切断(DSB)を導入することにより、例えば5.これらの技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された調節間短いパリンドロミック反復(CRISPR/Cas9)を含め、その軌跡における目的の任意の遺伝子の操作を可能にする。最新のCRISPR/Cas9システムは、ゲノム内の特定の部位でDSBを生成するようにCas9ヌクレアーゼを指示するガイドRNA(gRNA)で構成されています。このシステムは、最も伝統的に治療が困難な生物5においても、任意の細胞または標的組織における内因性遺伝子を改変する際に広範な認識を得ている。シンプルさ、スピード、効率性により、他のシステムに対して複数の利点があります。
腫瘍学では、CRISPR/CAS9技術は効果的に癌細胞を模倣する必要性を満たしています。HNCでこのシステムを確立するために、我々は強力なKRAS腫瘍遺伝子と2つの重要な腫瘍抑制遺伝子、APCおよびp536を操作した。GENIE データベース7によると、この組み合わせは HNC ではまれです。RAS突然変異(HRAS、NRAS、およびKRAS)は、すべてのHNC集団の約7%にしか存在しない。これらの腫瘍は、治療8、9に耐性である傾向がある。
Cas9とそのgRNAの送達は、AAVまたはレンチウイルスのいずれかを使用してウイルス導入を介して達成される。組換えAAVは、多くの場合、その高い力力、軽度の免疫応答、細胞の広い範囲を伝達する能力、および全体的な安全性に起因する標的細胞に遺伝子を送達するための好ましい方法です。AAVシステムを用いて、種々の組織特異的マウス細胞株が生成され、新しい細胞株が10、11、12で開発されている。しかし、マウスHNC細胞株モデル細胞を生成できる効率的なゲノム編集システムは未だに開発されている。本研究では、原発マウス舌細胞を腫瘍原性状態に変換するためのin vitro AAV-Cas9ベースのシステムの開発を模索した。このユニークなCRISPR/Cas9変換プロトコルと確立された腫瘍細胞株は、ゲノム変化の多様性によって誘発されるHNCの生物学をよりよく理解するために使用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は、ネゲブ動物ケア・使用委員会のベン・グリオン大学によって承認されました。動物実験は、IACUC(IL.80-12-2015およびIL.29-05-2018(E))によって承認された。本研究で用いられた動物実験、住宅、環境条件のすべての側面は、実験動物のケアと使用のためのガイド13に準拠していました。
1. アデノ関連ウイルス産生
- 1日目:細胞培養
- DMEMの15 mLで14.5 cmプレートあたり種子4 x 106 HEK293T細胞。ポリエチレンニミン(PEI)(1μg/μL)でトランスフェクション用に10枚のプレートを用意します。
- 2日目:PEIを用いたHEK293T細胞のトランスフェクション
- メディアを取り外し、トランスフェクションの前に暖かいDMEM 1時間で再フィードします。
- 前温トランスフェクション試薬およびDMEM。
- AAV ITR(AAV pCM109 EFSクレSG APC Sg KRAS sg P53-KRAS HDR)を含む目的のプラスミドの10μgを使用して、AAV 2/9nキャプシドプラスミドの10μg(AAV2のrep遺伝子とAAV9のキャップ遺伝子を使用して、 プレートあたりのヘルパープラスミド(pAdDelta F5ヘルパー)の10μg(材料表を参照)。
注:AAV生産にも使用できるヘルパープラスミドの新世代 - pAdDeltaF614、15、16が利用可能です。 - プレートあたりプレーンDMEMの1 mLでプラスミドを混合します。次に、90 μLのポリエチレニミン(総プラスミド:PEI濃度=1:3)をプラスミドミックスとボルテックスに簡単に加えます。
- PEI-プラスミドDNAミックスを室温で20分間インキュベートする(RT)。
- HEK293T細胞の上にミックスをドロップワイズで加え、プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに移し、24時間5%CO2で行います。
- 3日目:トランスフェクション後の中程度の変化
- メディアを完全に取り外し、15 mLの新鮮なDMEMを追加します。
- 5日目:ウイルスの収穫
- ドライアイス/エタノールバスを用意します。
- 細胞スクレーパーで細胞を収集し、50 mLチューブ(50 mLチューブあたり2プレート)に移します。
- 室温で15分間800 x gでスピンチューブ。
- すべてのチューブから上清を捨てます。1プレートあたり0.5 mLのリシスバッファー(150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH = 8.5)を最初のチューブのみに追加します(10プレートの場合は5mL)。細胞を再サスペンドし、合計体積を次のチューブに移し、最後のチューブまで続けます。
- セル懸濁液を新鮮な50mLチューブに移します。ステップ1.4.4で説明したのと同じ転写方法を使用して、同じ体積のリシス緩衝液(プレートあたり0.5 mL)でチューブを洗浄します。
- 乾燥氷/エタノール浴と37°水浴の間の細胞懸濁液を~10分の凍結/解凍サイクルの3ラウンドに供する。各解凍後に簡単に渦。
- 精製が同じ日に行われる場合は、RTで平衡バッファーと溶出バッファー(レシピについては表1を参照)を設定します。
- プレートあたり50単位のベンゾラーゼを加え、37°Cで1.5時間インキュベートします。
注:ベンゾラーゼは、宿主の培養細胞および細胞懸濁液中に存在するプラスミドDNAから残留核酸を消化するために使用される。 - チューブを3,000 x gで4°Cで15分間回転させます。
- 18 Gスチール針を使用してシリンジで上清を収集し、溶液を0.45μmフィルターを通して15 mLチューブに押し込み、粗溶解物を得ます。
- 精製または精製を続行するまで、粗リサートを4°Cで数週間保存します。
2. AAV精製
- 5日目以降
- 平衡と溶出バッファをRTに配置します。
- 平衡バッファーの10 mLでクロマトグラフィーカラムを洗浄します。
- ヘパリンアガロースのプレートあたり0.5 mLをカラム17に加え、平衡バッファー(ヘパリンアガロースの体積の4倍)を加えます。カラムを反転させて溶液を混ぜ、アガロースを堆積させます。
- 重みによって柱から平衡バッファーを溶出します。
メモ:アガロースが乾燥するのを防ぐために、平衡バッファーを残します。 - 粗リサーテをカラムにロードし、一定の攪拌で4°Cで2時間インキュベートします。カラムを直立した位置に持ち込み、アガロースが堆積できるようにします。
- 粗いライサートを重力で溶かします。
- 平衡バッファー(ヘパリンアガロースの体積の4倍)でカラムを洗浄します。
- カラムの下に100kDa遠心タンパク質フィルターを置き、溶出緩衝液(ヘパリンアガローの体積3倍)を使用してウイルスをフィルターに溶出させる。
注: 溶出バッファは 15 mL を超えるべきではありません。 - フィルターが1mL未満になるまで3,000 x gでフィルタを~30分間遠心分離する。
- フィルターをPBSで満たし、3,000 x gで~30分間、フィルターに1mL未満になるまで充填します。すべての塩を除去するには、この手順2xを繰り返します。
- ウイルス溶液を3,000 x gで遠心分離してフィルターに濃縮し、できるだけ小さい体積(200°L未満)に到達します。
- 針と注射器でウイルス溶液を吸引し、チューブに0.22μmフィルターを介して溶液をプッシュします。
- 貯蔵のための濃縮されたウイルス粒子のアリコートを作る。
注:アリコートは、4°Cでの短期保存の場合は~20μL、-80°Cでの長期保存の場合は~5°Lである必要があります。 - 前に説明した14、18、19、20に記載のウイルス性チイタおよびウイルス伝達効率を決定する。
3. 一次細胞の単離と培養
- 1日目
- 6週齢の男性または女性B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)FEzh/JによりCO2窒息または他のIACUC承認プロトコルを安楽死させる。
注:これらのCRISPR/Cas9ノッキンマウスは、CAGプロモーターによって指示されたcas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPのクレコンビナーゼ依存的発現を有する。これらのマウスのゲノム中に存在する上流のLox-Stop-Lox(LSL)配列は、クレリコンビナーゼがない場合のCas9およびEGFPの発現を防止する。単一ガイドRNA(sgRNA)およびCreソースと組み合わせて使用すると、それらは生体内またはex vivo14で単一または複数のマウス遺伝子の編集を可能にする。 - 外科的はさみを用いて安楽死マウスから舌を解剖する。
- メスを使って舌組織を非常に小さな断片にミンチして組織を手動で解解解する。4.5mlのRPMIプレーン培地(血清を含む)を含む15mLチューブで組織断片を収集します。
- 三重酵素ミックス(200°L)を組織断片に加えます(レシピについては表1を参照)。
- 37°Cで30分間組織酵素ミックスをインキュベートし、10分ごとにチューブをタップして組織の酵素解離を強化します。
- HBSS/PBSを含む5%のウシ血清(FBS)を組織酵素ミックスに加えると、酵素作用を停止します。
- 滅菌70μmのナイロンメッシュを通して上記の細胞懸濁液を濾過し、分散した細胞とより大きな組織断片を分離します。
- フィルター処理した細胞懸濁液を、RTのHBSS/PBSで5分間、300 x gの遠心分離で洗浄します。
- 培養培地(RPMI/DMEMで10%FBS)でペレットを再サスペンドし、異なる細胞コロニーが形成されるまで60mm培養皿で成長する。
- 培養細胞凝集体は、細胞コロニーが形成されるまで3mLの完全な媒体(RPMI/DMEMで10%FBS)を含む60mm培養皿でフィルターの上に保持される。
- 培養1週間後に線維芽細胞汚染の存在について一次細胞を顕微鏡で調べる。凝集体および細胞懸濁液から開発された一次細胞を、37°Cで0.25トリプシン0.02%EDTA溶液で1分間治療し、線維芽細胞を除去します。
注:通常、細胞凝集体からの一次培養は、単一細胞懸濁液と比較してより多くのコロニーを産生する。これらのコロニーからの細胞は、AAV伝達とより良い伝達効率を提供する。
- 6週齢の男性または女性B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)FEzh/JによりCO2窒息または他のIACUC承認プロトコルを安楽死させる。
4. 一次細胞のAAV伝達
- 10日目
- 完全な媒体の2 mLの6ウェルプレートの井戸あたり種子2 x 105一次細胞(RPMI/DMEMの10%FBS)。
- 翌日、10個の12個のウイルスゲノム/mL(1010形質導入ユニット/mL)で細胞を伝達し、ウイルス粒子含有媒体中の細胞を37°Cで48時間インキュベートする。
- ウイルス粒子含有媒体を除去し、AAV形取り細胞に完全な媒体を供給します。
注:伝播を受けた細胞だけがGFPを発現し、増殖し始めます。形質導入を受けなかった細胞は、最終的に2週間以内に死ぬ。 - 培養展開の2週間後、細胞を種子検査用に、そして生体内腫瘍原性実験を行う。
注:Cas9マウスのAAVトランス誘導細胞および正常一次細胞からのゲノムDNAを抽出し、標準プロトコルを用いて特定のゲノム編集を検証した。抽出されたDNAのシーケンシングおよび配列データの分析(表2)は、前に説明したようにハイブリダイゼーションキャプチャベースの次世代シーケンシングアッセイ(例えば、MSK-IMPACTプラットフォーム)を用いて行った。
5. 免疫蛍光とウェスタンブロッティングを用いた正常細胞の腫瘍原細胞への形質転換の検証
- 免疫蛍光
- 12 mmガラスカバーリップに2 x 105細胞をシードし、一晩インキュベーターに入れます。
- PBS(pH=7.4)の4%パラホルムアルデヒド中の細胞を固定し、免疫蛍光標識のプロセスを行う。
- PBSTの1%BSAまたは1%血清中の第1次抗体を用いて固定細胞を、RTで1時間または4°Cで一晩1時間、加湿室でインキュベートする。使用される一次抗体は、ウサギモノクローナル抗KRT14、ウサギモノクローナル抗E-カドヘリン抗体、およびCas9マウスmAbである。
- 1x PBSで細胞3xを5分間洗浄して、カバーリップから一次抗体溶液を取り除きます。
- 暗闇の中でRTで1時間PBSTで5%BSAでCy3ロバ抗ウサギIgGおよび/またはCy3ヤギ抗マウスIgG二次抗体を用いて細胞をインキュベートする。
- カバースリップから二次抗体溶液を取り出し、ステップ5.1.4の説明に従って細胞3xを洗浄します。
- DAPI(DAPIフルオロマウント)を含む取り付け媒体の滴でカバースリップを取り付けます。
- スライドが蛍光顕微鏡を使用して画像化されるまで、暗闇の中で4°Cで保存します。
- ウェスタンブロッティング
- 種子1 x106は、100ミリメートル培養皿で細胞を形質転換し、一晩インキュベーターに入れます。
- 形質転換した細胞を200μlの氷冷PBSに洗浄し、掻き取る。
- 細胞懸濁液を含むチューブを4°Cで2,000 x gで10分間遠心分離し、細胞をペレット化する。
- 上清を吸引し、リン酸緩衝液を用いて細胞を分解する(表1参照)。10,000 x gおよび 4 °C で 10 分間のリゼを遠心分離し、クリアされたリゼを収集します。
- 市販のブラッドフォードアッセイキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。4xサンプルバッファー(500 mM Tris pH = 6.8、40%グリセロール、8%SDS、20%H2O、0.02%ブロモフェノールブルー)を使用して、タンパク質サンプルを0.5または1μg/μLで5分間沸騰させます。
メモ:サンプルは-80°Cで、またはウェスタンブロット分析が実行されるまで保存することができます。 - 全リサートの等量(30μg)を10%ドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離します。染料がゲルの底部に達していることを確認します。25Vで30分間半ドライブロッティングでナイロン膜にタンパク質を移します。
- トリス緩衝生理線(TBS)-0.1%ツイーン(TBST)に5%BSAを注ぎ、完全に覆います。一次抗体(抗クレ、抗Cas9、抗GFP、抗βカテニン、抗p53、抗ホスホERK、および5%BSA TBSTで希釈した抗βアクチン)でメブラーネを1時間ブロックします。
- インキュベーション後、1x TBSTで膜を10分間洗浄し、溶液が膜を完全に覆っていることを確認します。この洗浄3xを行い、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗体(5%BSA TBSTで1:10,000希釈)を膜に加えます。RTで1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、1x TBSTで膜を10分間洗浄し、溶液が膜を完全に覆っていることを確認します。化学発光イメージング(材料表参照)を実行してバンドを露出させ、それに応じて画像をキャプチャします。
- 免疫担当マウスにおける形質転換細胞の腫瘍原性電位の検証
注:マウスは、ネゲブのベングリオン大学の制度的ガイドラインに従って維持され、治療されました。うなずく。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)およびC57BL/6マウスを生体内研究に用いた。マウスは、12時間の光/暗いサイクルで空気濾過された層流キャビネットに収容され、食物と水のアドリビタムを供給された。- 6-8週齢の女性NODを使用してください。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)およびC57BL/6マウスの研究用。
- AAV-Cas9形質転換細胞をトリプシン化する。37°Cで前温したDMEMを使用してトリプシン化を停止し、50 mLチューブで収集します。
- 室温で10分間、800 x gでチューブを遠心分離します。上清を廃棄し、FBSなしでDMEM培地中の細胞ペレットを再サスペンドします。遠心分離をもう一度実行し、1x PBSで細胞ペレットを再サスペンドします。
注: セルを 1x PBS に長時間保持しないでください。細胞の塊を防ぐために、常に細胞懸濁液を氷の上に置いてください。 - 自動セルカウンタを使用して細胞をカウントし、1x PBS を使用して細胞を目的の濃度(2.5 x 107セル/mL)に希釈します。各NODの右側にAAV-Cas9形質転換細胞懸濁液の皮下注射を介して腫瘍を生成する。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)マウス(2 x 106セル/マウス)。同系マウスで直交異方性モデルを生成するには、0.5× 106一次細胞またはAAV-Cas9形質細胞をC57BL/6免疫担当マウスの舌に注入する。
- CO2窒息による2週間の後注入で動物を安楽死させ、免疫ヒストケミストリー分析のために安楽死マウスから腫瘍を解剖する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AAV システムを使用して正常な Cas9 セルを変換する
図1は、本研究で用いられるAAVトランスジーンプラスミドの詳細なベクターマップを提供する。図 2は、AAV-Cas9 ベースシステムの設計と動作の概要を示しています。ウイルス粒子を生成するために、HEK293T細胞をPEIトランスフェクション法を用いてAAVトランスジーンベクターおよび他のウイルス包装ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、ウイルス含有細胞を回収してリゼし、ヘパリンアガロース精製工程を用いて、ウイルス粒子を精製および濃縮した(図2A)。これらの精製されたウイルス粒子は、Cas9マウスから単離された一次細胞のin vitro形質転換に使用され、有効性を確認した。我々のシステムでは、AAVトランスジーン発現カセットは、ユビキタスCAGプロモーター(pCAG)、LoxP-Stop-LoxPカセット(LSL)、Cas9ヌクレアーゼ遺伝子、自己切断P2Aペプチド、およびレポーター遺伝子(EGFP)を2つのホモロアームを担うマウス細胞内のCre依存性Cas9 Rosa26ターゲティングテンプレートに相同な組み換えを通じて導入される。形質動細胞のCre組換え活性はLSLを励起し、Cas9およびGFP発現を誘導する(図2B)。Cas9ヌクレアーゼ活性は、gRNAを介して誘導される目的部位で二本鎖断絶を導入し、遺伝子編集に役立ちます。本研究で用いられるAAVシステムは、多重化されたgRNA(KRAS、p53、APC用のsgRNA)を送達し、また、形質誘発細胞における相同性修復(HDR)を介して発がん性KRASG12Dアレルを発現するのに役立ちます。
図1:本研究で用いられているAAVトランスジーンプラスミドのベクターマップこのAAVシステムは、クレコンビナーゼとKRAS、p53、およびAPCを対象とする3つのU6駆動sgRNAを表すAAVバックボーンを備えています。また、KRAS G12D相同性修復(HDR)ドナーが含まれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:正常細胞の形変換におけるAAV-Cas9システムの設計と動作(A)ヘク293TからのAAV粒子の製造及び精製の概要を、AAVトランスジーン及び包装プラスミドでトランスフェクトした後の。(B)AAV粒子を用いた一次細胞のウイルス伝達と、Cre依存性Cas9発現がCRISPR編集および腫瘍細胞への原細胞の形質転換を可能にするメカニズム。Creリコンビナーゼ発現カセットを用いたHDRを介した3つの異なる遺伝子に対するgRNAを結合した単一のAAVベクターをクレ依存性Cas9マウス一次細胞に送達した。形質動細胞におけるCre組換え活性は、LoxP-Stop-LoxPカセットの切除につながり、Cas9およびGFP発現を誘導する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
単離マウス胚性線維芽細胞におけるAAV-Cas9システムin vitroの検証
原発マウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞は、細胞増殖および増殖における遺伝子アブレーションの結果を研究するために排他的に使用されている。正常細胞の形質転換におけるAAV-Cas9系の効率を検証するために、Cas9マウス胚(E14)から単離されたMEF細胞をAAVで転写した。MEF細胞を前に説明したように単離した23、24.14日前のCas9マウス胚のMEFは、インビトロで培養およびトランスデュースが容易であるために使用されました。簡単に言えば、AAV転起を介してMEFを変換するために、約30%の合流で一次MEFが伝達の準備ができていると考えられました。転起1時間前に、MEF培養媒体が変更された。精製されたAAVを氷の上で解凍し、MEF培養媒体を吸引した。106-1014から変化するチタを有するウイルス上清を各ウェルに添加し、37°Cで一晩インキュベートした。ウイルス上清を48時間後に除去し、MEF培養培地の2mLに置換し、次いでGFP発現まで37°Cでインキュベートし、約5日後に導入した。GFP 発現 MEF はサブカルチャー化され、検証されました。このベクターでは、10個の12個のウイルスゲノム/mL(10個の10個のトランスデューシングユニット/mLに相当)が、原発性MEF細胞を腫瘍原性MEFに効率的に変換できることがわかりました(図3A)。形質転換細胞はCre、Cas9、およびGFPを発現した(図3B,C)。AAV形質転換MEF細胞の腫瘍原性電位にアクセスするために、0.5x 106細胞(一次/AAV形質転換MEF)をNOD-SCIDマウス中の舌、唇、および皮下に注入した。形質転換細胞はこれらのマウスで腫瘍を形成し、腫瘍を形成しなかった原発性MEFと比較して(図3D-F)。
図3:AAV-Cas9システムを用いた一次MEF細胞の検証および体外変換(A)AAV粒子を用いてCas9マウスから採取した胚からの線維芽細胞の体外変換の概要(B)GFP、クレ、およびCas9の発現を示す一次MEFおよびAAV形質転換MEF細胞の代表的な免疫蛍光画像。DAPIは核を染色するために使用された。(C)胚性正常線維芽細胞および遺伝子編集線維芽細胞におけるCre、Cas9、GFP、およびβアクチンを示すウェスタンブロッティング。(D)形質転換線維芽細胞を注入した後にNOD-SCIDマウスで発症した舌腫瘍の代表的な画像。(E)形質転換線維芽細胞を注入した後にNOD-SCIDマウスで形成された唇腫瘍の代表的な画像。(F)形質転換線維芽細胞を注入した後にNOD-SCIDマウスで発症した脇腹腫瘍の代表的な画像。矢印は腫瘍を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
AAV-Cas9系を用いた原発性舌上皮細胞株のインビトロ生成
MEF細胞を用いてAAV系の形容性を検証した後、Cas9マウスから一次舌上皮細胞を単離し、インビトロで培養した。一次舌細胞をAAVウイルス粒子(1010 cfu/mL)で形質転換し、1週間後に細胞がGFPを発現し始めた。原発性舌上皮細胞の腫瘍原性形質転換(図4A)は、免疫蛍光およびウェスタンブロッティングを用いて確認した(図4B,C)。形質転換された細胞は、強化されたKRT14、E−カドヘリン、およびGFP発現を示す(図4B)。原発性舌上皮細胞の腫瘍原性形質転換は、GFPの発現(すなわち、Cas9およびGFPのCre依存性発現)によって確認された(図4C)。KRT14およびE-カドヘリンの発現は、それらの上皮細胞特性を確認する。タンパク質検証は、増強されたβ-カテニン、ホスホ-ERK、および減少したp53発現(図4C)を確認し、APCおよびp53の有効なダウンレギュレーションおよび変異型KRASの舌細胞への組み込みを示し、腫瘍原性を作り出した。形質転換細胞から単離されたDNAの深層シーケンシングによるゲノム解析により、AAV-Cas9系によるTP53およびAPC遺伝子の有効な遺伝子編集およびフレームシフトを確認した(表2)。AAV形質転換舌細胞株の腫瘍原性を、免疫担当野生型C57BL/6マウスの舌に注入することによってさらに評価した。形質転換された舌細胞を、舌のKRAS変異型上皮細胞(KRAS Mut EpT)として指定し、C57BL/6マウスにおいて効率的に腫瘍を形成する(図4D)。KRAS Mut EpT腫瘍は、経口および顎顔面病理学者によって、ルーチンヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および免疫ヒストケミストリーによって評価された。腫瘍は、著名な核アティピアを有する紡錘細胞形態を示した:多形性、超色素、巨大核、いくつかの核、および非定型有糸分裂性の数字を有する高い有糸分裂率。血管外侵および血管浸潤も指摘された。これらの形態学的特徴は、存在しない腫瘍関連炎症に非常に限定的であった。免疫組織学的に、腫瘍細胞は、E−カドヘリンおよびKRT14に対して細胞質的に陽性であり、両方の上皮組織のマーカーであった。KRT14は扁平上皮の典型的な、腫瘍細胞の扁平上皮起源および従って扁平上皮癌の診断を支持する(図4E)。したがって、このアプローチは、所望の遺伝子改変を有するインビトロで一次細胞を形質転換するための多目的な方法論を提供する。さらに、この方法論は、実際の腫瘍微小環境ミリューにおける新生物のより良い理解のために、同系マウスにおける生体内でこれらの開発された細胞株の使用を容易にする。
図4:AAV-Cas9系を用いた一次舌上皮細胞の体外形形変換。(A)Cas9マウスの舌から得られた正常上皮細胞の体外形変換の概略表現。(B)KRT14、E-カドヘリン、およびGFPの発現を示すAAV形質転換舌上皮細胞の代表的な免疫蛍光画像。(C)Cas9、βカテニン、およびホスホERKアップレギュレーションをp53タンパク質レベル下付けで示すウェスタンブロットは、遺伝子編集された上皮細胞を示す。(D)形質転換舌上皮細胞(KRAS Mut EpT)を注入した後に免疫担当マウスの舌に発症した腫瘍の代表的な画像。(E)H&E、E-カドヘリン、およびKRT 14染色のための腫瘍組織切片の代表的な画像を20倍および40倍の倍率で行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ウイルス収穫のための細胞リシスバッファー | ボリューム |
| 150 mM ナCl | 876.6グラム |
| 50 mM トリス HCl | 605.7グラム |
| HCl を使用して pH 8.5 を調整する | |
| 分子グレードの水 | 最大100 mL |
| 平衡バッファー | |
| 1 mM MgCl2 | 9.52 mg |
| 2.5 mM KCl | 18.64グラム |
| PBS 1Xですべてをミックスし、pHを7.2に調整 | 最大100 mL |
| 溶出バッファー | |
| 0.5 M ナCl | 2.92グラム |
| PBS 1Xですべてをミックスし、pHを7.2に調整 | 最大100 mL |
| 10Xトリプル酵素ストックソリューション: | |
| コラゲナーゼ | 1 g 最終簡潔な [ 10 mg/ml] |
| ヒアルロニダーゼ | 100 mg [1 mg/ml] |
| DNase | 20,000 ユニット 最終 conc. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | 最大100 mL |
| プラスミドミックス(1枚用14.5cmプレート用) | |
| AAV pCM109 EFS クレ sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10μg |
| AAV 2/9 キャプシドベクトル | 10μg |
| pAD デルタ F5 ヘルパー | 10μg |
| PEI (1μg/°L ストック) | 90°L |
| DMEM | 1 mL |
表1:本研究で用いられる緩衝液のレシピ
表2:クラスMut EpT細胞のゲノム解析データここをクリックしてこのテーブルを表示してください (右クリックしてダウンロードしてください)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
いくつかの方法は、以前に成功の程度が可変で培養中の一次細胞を変換するために使用されてきました25,26,27,28.これらの方法のほとんどは、形質転換14、17、18、19にマウス線維芽細胞を使用するか、または4-ニトロキノリン-1-オキシド(4-NQO)21、22などの発がん性物質を使用してマウス細胞株モデルを開発する。 ノックアウトおよびトランスジェニックマウスモデルの使用はまた、HNCの発達と分化を支配する様々な分子経路についての理解を大幅に高めました。ユニークな遺伝的パターンを持つマウス経口上皮細胞株の使用は確かにこれらの研究を補完し、その後の生化学的アッセイは、HNCの治療と診断に貢献するであろう。しかしながら、マウス経口上皮細胞28、29、30、31、32、33の樹立を記載した報告はごくわずかであり、これらの細胞株は広く使用されていない。
これらのマウス経口上皮細胞株の主な制限は、それらが分子レベルで広範囲に特徴付けされず、珍しい遺伝子パターンを発現することが判明した。したがって、これらのマウス細胞株モデルの限られた分子理解と効率的な方法論の欠如により、マウス細胞株を確立するためのCas9ノックインマウスにおけるAAV-CRISPRゲノム編集技術のユニークな可能性を活用する特定の遺伝子改変。本研究では、原発性マウス細胞を腫瘍原性状態に変換し、癌細胞を生じる遺伝子改変を確認するin vitro AAV-Cas9システムを導入・開発した。AAV媒介CRISPRによる体細胞遺伝子編集を複数のsgRNA組み合わせで高効率で特異的遺伝子変異を有するマウス舌上皮細胞の確立に成功しました。
この方法論は、HNCの細胞自律病因をよりよく理解するための新しい実験的アプローチを提供する。マウス原発性舌上皮細胞を皮切りに、限られた遺伝子セットを削除し、単一のKRAS変異を導入することで、このような細胞を腫瘍原性に変換することができました。この方法論を用いて、他の癌に関与することが知られている他の遺伝子がHNCに近い悪性腫瘍を産生できるかどうかを調べることができるようになりました。KRAS Mut EpTからの腫瘍の形態学的特徴は扁平上皮癌を確認した。同系マウスにおけるKRAS Mut EpT腫瘍の組織病理学的解析は、頭頸部癌の積極的な生物学的行動に関連し、支持する。したがって、癌細胞の遺伝子型を腫瘍の特定の臨床的および組織病理学的特徴に連結することができるかもしれない。
この方法論の主な利点は、特定の遺伝子変異を使用して任意の臓器から一次細胞から細胞株を開発する能力とAAV-Cas9の使用であり、システムをより堅牢で安定させる。内因性Cas9システムは、他の遺伝子ノックアウトを利用することを可能にする。現在の方法論の主な欠点は、一次培養と、一次細胞を転置するのに必要なウイルス粒子の高いチッターを単離して確立するのに必要な時間である。ただし、これは、各セルタイプの分離プロセスを標準化することによって克服することができます。効率的な転起のために高いAAVウイルスのチッターを必要とするという問題は、ウイルス包装のためのより良い精製プロセスのためのキャプシドおよびヘルパープラスミドの最新世代の使用によって緩和され得る。
将来的には、より良く、より効率的なAAVシステムを設計し、臓器特異的遺伝子組み換え腫瘍モデルを作るために生体内で外挿することができます。結論として、このアプローチによってマウス細胞株を確立することは、腫瘍学の文脈でいくつかの仮説をテストするための貴重なインビトロ細胞培養ベースのツールとして役立つであろう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.S.はバイオサイエンス研究所の諮問委員会にて、メナリーニ・リケルシュはプーマバイオテクノロジー、第一三潮、タルグミン、免疫薬、メナリーニ・リケルシュから研究資金を受け取っています。M.S.はメデンディ・メディカル・トラベルの共同創設者でもあり、過去2年間にメナリーニ・リケルシュとADCファーマから名誉を受けています。他のすべての著者は、開示するものは何もありません。
Acknowledgments
pAdデルタ5ヘルパープラスミドを提供してくれたダニエル・ギトラー博士に感謝します。この作品はイスラエル科学財団(ISF、 700/16(ME)、米国・イスラエル二国籍科学財団(BSF、2017323)(MEおよびMS)、イスラエル癌協会(ICA、20170024)(ME)、イスラエル癌研究財団(ICRF、17-1693-RCDA)(ME)、懸念財団(#7895)(ME)。フェローシップ:私とBGUクリットマンへのアロン・フェローシップとSJとMPへのフェローシップ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N.
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D.
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
