एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर Murine सिर और गर्दन कैंसर सेल लाइन के विट्रो स्थापना में एक Adeno-एसोसिएटेड वायरस-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर
Summary
सिर और गर्दन के कैंसर के रोगियों में उत्परिवर्तन विशिष्ट जीन के साथ मूत्र मॉडल के विकास के लिए नियोप्लासिया की समझ के लिए आवश्यक है । यहां, हम विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ मूत्र एचएनसी सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एडेनो-संबद्ध वायरस-Cas9 प्रणाली का उपयोग करके प्राथमिक मूत्र जीभ कोशिकाओं के इन विट्रो परिवर्तन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
प्राथमिक सामान्य एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग संकुल नियामक इंटरस्पेस का उपयोग करके ऑनकोजीन और ट्यूमर दमन जीन में विशिष्ट उत्परिवर्तन शुरू करके सेलुलर परिवर्तन के लिए आवश्यक जीनोमिक परिवर्तनों को पुन: उत्पन्न करना संभव बनाता है। चूहों में शॉर्ट पैसिंड्रोमिक रिपीट (CRISPR) आधारित जीनोम एडिटिंग तकनीक। यह तकनीक हमें चूहों का उपयोग करके मानव कैंसर में होने वाले आनुवंशिक परिवर्तनों की सही नकल करने की अनुमति देती है। आनुवंशिक रूप से मूत्र प्राथमिक कोशिकाओं को बदलने से, हम बेहतर कैंसर के विकास, प्रगति, उपचार, और निदान का अध्ययन कर सकते हैं । इस अध्ययन में, हमने विट्रो में एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का उपयोग करके जीनोम संपादन को सक्षम करने के लिए क्रे-प्रेरक Cas9 माउस जीभ एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया। विशेष रूप से, सामान्य जीभ एपिथेलियल कोशिकाओं में KRAS, p53 और एपीसी में फेरबदल करके, हमने विट्रो में एक मूत्र सिर और गर्दन के कैंसर (एचएनसी) सेल लाइन उत्पन्न की, जो सिंजेनिक चूहों में ट्यूमरहै। यहां प्रस्तुत विधि विस्तार से वर्णन करती है कि विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ एचएनसी सेल लाइनें कैसे उत्पन्न करें और सिंजेनिक चूहों में ट्यूमर प्रगति की भविष्यवाणी करने के लिए उनकी उपयुक्तता को बताते हैं। हम कल्पना करते हैं कि यह आशाजनक विधि ट्यूमर जीव विज्ञान और एचएनसी की चिकित्सा का अध्ययन करने के लिए जानकारीपूर्ण और उपयोगी होगी।
Introduction
एचएनसी दुनिया भर में एक आम द्रोह है1। एचएनसी नियोप्लासिया की उत्पत्ति मॉडलिंग वर्तमान में एक वैज्ञानिक मोड़2पर है । जबकि एचएनसी2,3,4 (जैसे, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, और RAS) में कई आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई है, एचएनसी को प्रेरित करने के लिए संगीत कार्यक्रम में आवश्यक जीनोमिक परिवर्तन ों के विशिष्ट संयोजन अस्पष्ट बने हुए हैं।
मानव एचएनसी सेल लाइनों के वर्तमान उपयोग ने रोगजनन और उपचार 3 से जुड़े तंत्रों को स्पष्ट करने में काफी मदद कीहै। हालांकि, इम्यूनोसमझौता म्यूरिन सिस्टम में मानव कोशिका लाइनों के अध्ययन की अपनी सीमाएं हैं, क्योंकि ये प्रणालियां वीवो नियोप्लास्टिक प्रक्रिया, विशिष्ट जीन म्यूटेशन की भूमिका और प्रतिरक्षा माइक्रोएनवायरमेंट में उपचार प्रतिक्रियाओं को संबोधित नहीं करती हैं। इसलिए, विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ मूत्र कोशिका रेखाओं का विकास और स्थापना प्राथमिक महत्व का है कि परिवर्तन प्रक्रिया में विभिन्न जीन कैसे योगदान देते हैं और इम्यूनोसक्षम चूहों में उपन्यास अणु आधारित उपचारों का परीक्षण करते हैं।
जैव चिकित्सा अनुसंधान में जीन फ़ंक्शन अध्ययन डीएनए संपादन प्रौद्योगिकियों में प्रगति से काफी प्रभावित हुए हैं, उदाहरण के लिए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) शुरू करके, उदाहरण के लिए5। जिंक फिंगर न्यूकलीज, ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर जैसे इफेक्टर न्यूक्लोप्स, और क्लस्टर रेगुलेटरी इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR/Cas9) के इस्तेमाल सहित ये तकनीकें अपने लोकस पर ब्याज के किसी भी जीन के हेरफेर के लिए अनुमति देती हैं । नवीनतम CRISPR/Cas9 सिस्टम एक गाइड आरएनए (gRNA) है कि Cas9 nuclease जीनोम में एक विशिष्ट साइट पर एक DSB उत्पन्न करने के लिए निर्देश के शामिल है । इस प्रणाली ने किसी भी कोशिका या लक्षित ऊतक में एंडोजेनस जीन को संशोधित करने में व्यापक मान्यता प्राप्त की है, यहां तक कि सबसे पारंपरिक रूप से कठिन-से-इलाज जीवों मेंभी 5। इसकी सादगी, गति और दक्षता के कारण अन्य प्रणालियों पर कई फायदे हैं।
ऑन्कोलॉजी में, CRISPR/CAS9 प्रौद्योगिकी ने कैंसर कोशिकाओं की प्रभावी नकल करने की आवश्यकता को पूरा किया है । एचएनसी में इस प्रणाली को स्थापित करने के लिए, हमने शक्तिशाली KRAS ऑनकोजीन और दो महत्वपूर्ण ट्यूमर दमन कंप्टर जीन, एपीसी और p536में हेरफेर किया। जिन्न डाटाबेस7के अनुसार, यह संयोजन एचएनसी में दुर्लभ है। आरएएस म्यूटेशन (एचआरएएस, एनआरएएस और केआरएस) सभी एचएनसी आबादी के केवल ~ 7% में मौजूद हैं। ये ट्यूमर8,9चिकित्सा के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं ।
Cas9 और उसके gRNA की डिलीवरी वायरल ट्रांसड्यूक्शन के माध्यम से या तो AAVs या लेंटिवायरस का उपयोग कर हासिल की है । Recombinant AAV अक्सर जीन देने के लिए अपने उच्च titer, हल्के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला ट्रांसड्यू करने की क्षमता के कारण कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पसंदीदा तरीका है, और समग्र सुरक्षा । एएवी प्रणाली का उपयोग करके, विभिन्न ऊतक-विशिष्ट माउस सेल लाइनें उत्पन्न की गई हैं, और नई सेल लाइनें अभी भी10,11,12विकसित की जा रही हैं। हालांकि, एक कुशल जीनोमिक संपादन प्रणाली जो मूत्र एचएनसी सेल लाइन मॉडल कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकती है, विकसित किया जाना बाकी है। इस अध्ययन में, हमने प्राथमिक मूत्र जीभ कोशिकाओं को ट्यूमरजनक स्थिति में बदलने के लिए इन विट्रो एएवी-कै9-आधारित प्रणाली विकसित करने की मांग की। इस अद्वितीय CRISPR/Cas9 परिवर्तन प्रोटोकॉल और स्थापित ट्यूमर सेल लाइन बेहतर जीनोमिक परिवर्तन की विविधता से प्रेरित HNC के जीव विज्ञान को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति में प्राथमिक कोशिकाओं को बदलने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है , जिसमेंसफलता25, 26,27,28की परिवर्तनीय डिग्री है । इनमें से अधिकांश विधियां परि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ डैनियल Gitler हमें pAd डेल्टा 5 सहायक प्लाज्मिड के साथ प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ, 700/16) (एमई), संयुक्त राज्य अमेरिका-इज़राइल द्विराष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (बीएसएफ, 2017323) (एमई और एमएस), इज़राइल कैंसर एसोसिएशन (आईसीए, 20170024) (एमई), इज़राइल कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (आईसीआरएफ, 17-1693-आरसीडीए) (एमई) और चिंता फाउंडेशन #7895 (एमई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फैलोशिप: एमई और बीजू क्रेटमैन को एसजे और एमपी में एलोन फेलोशिप ।
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
