ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס
Summary
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.
Abstract
החלבונים SNX-BAR הם מחלקה שימור אבולוציונית של שיפוץ הממברנה חלבונים המשחקים תפקידי מפתח במיון ובסחר של חלבונים ושומנים במהלך אנדוקציטוזה, מיון בתוך מערכת אנדוזוממית, ו האוטומטית. מרכזי לפונקציה SNX-BAR חלבון היא היכולת ליצור הומודימרס או הטרודימרים הקושרים ממברנות באמצעות שימור מאוד phox-הומולוגיה (PX) ו בר (Bin/אמפיפילפסין/מ א) תחומים. בנוסף, oligomerization של SNX-בר דימרס על ממברנות יכול לעורר את היווצרות tubules קרום ושלפוחיות ופעילות זו היא חשבה לשקף את התפקודים שלהם כמו חלבונים מעיל עבור הובלה אנדובית נגזר. החוקרים מנוצלים זמן רב במחקרים מחייב מבחנה באמצעות רקומביננטי SNX-BAR חלבונים על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar שלפוחיות ענק (GUVs) כדי לחשוף את האיפור המדויק של שומנים הדרושים כדי לנהוג שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את המנגנון שלהם של פעולה. עם זאת, בשל אתגרים טכניים עם מערכות ביטוי כפול, רעילות של ביטוי חלבון SNX-BAR בחיידקים, ואת מסיסות העניים של הפרט SNX-BAR חלבונים, רוב המחקרים עד כה נבדקו SNX-בר הומודימרס, כולל di, שאינם פיסיולוגיים הטופס במהלך הביטוי בחיידקים. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול כדי להתגבר על החסרונות העיקריים של מערכת ביטויים טיפוסית בקטריאלי. באמצעות זרימת עבודה זו, אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר בהצלחה כמויות גדולות של הטרודימרים SNX-BAR וכיצד ליצור מחדש אותם על ליפוזומים סינתטיים עבור כריכה ובטלציה assays אמר.
Introduction
ממברנה מאוגד אורגלים כגון קרום הפלזמה, הרשתית האנדופלזמית, מנגנון golgi, ליזוזום (שמרים בלואים), ו אנדוטיפ מהווים את מערכת endomembrane של התא איקריוטית. לרוב המארגנים יש את היכולת לתקשר ולהחליף חומר עם מנשאים אחרים באמצעות נושאות הובלה של שלפוחית לפוחית. כיצד התא מתאם את האריזה והיווצרות של נושאות הובלה שלפוחית לפוחית בתוך מערכת endomembrane אינו מובן היטב. עם זאת, החלבונים והשומנים המהווים חלק ניכר מהמערכת הendomembrane, ידועים כנובעים מהפנמה ושלפוחיות מקרום הפלזמה (PM). האנדוכמה היא הקבלה העיקרית לשלפוחיות אלה והיא מורכבת ממספר סטים של מערכות מחוברות. הפונקציה העיקרית של אנדוכמה היא להקל על רכישת מזינים, לווסת חלבון ומחזור השומנים, להגן מפני זיהום הפתוגן, ולשמש מקור החידוש העיקרי של שומנים עבור קרום הפלזמה. כמו אנדוכמה מקבל את רוב המטען של חלבונים ושומנים מקרום הפלזמה, הוא משמש תא מיון על ידי בידוד מטענים לתוך נושאות הובלה אנדוזומלית צינורי (etcs). חלבונים שאינם מחולק ל-ETCs נותרו להיות מושפל באמצעות מערכת האנדו-ליסוזומל. דיסרגולציה של מיון מטענים לתוך etcs יכול להוביל לאובדן ספיגת מזינים, מחזור החלבון או הומאוסטזיס ליפיד, וכתוצאה מכך רבים מטבולית, התפתחותית, הפרעות נוירולוגיות1,2. עם זאת, למרות התפקיד המרכזי etcs ב אנדוכמה, המנגנון הבסיסי של איך אנדוכמה יכול באופן סלקטיבי לתאם את האריזה של המון מטענים הטרוגנית לתוך נושאות צינורי אינו ידוע.
המשפחה nexin מיון (snx) הוא מחלקה שימור אבולוציונית של חלבונים שנמצאו להיות קריטי עבור תגובות הובלה שלפוחית רבים בתא3,4,5. מיון nexins מגויסים הממברנה אנדוזום וסיוע בלכידת מטענים באמצעות מאפיין phox הומולוגיה האופיינית (PX), אשר מאגד זרחן-monophosphate (2), השומנים מועשר בקרום אנדוזום. יונקים לקודד 33 SNX חלבונים, אשר ניתן לחלק עוד לתוך משפחות משנה מרובות, על פי נוכחותם של תחומים אחרים1. בעיקר, SNX-BAR משפחה היא המשפחה המשנה הגדולה ביותר המורכבת של שתים עשרה בבני אדם, בעוד שמרים להאביק, סכביסים cerevisiae ס, משפחת התת מופחת רק שבעה snx-בארים. החלבונים SNX-BAR יש גם תחום PX וגם Bin-אמפיפילוסין-מ א (בר) התחום המפעיל מאגרים שומנים לאגד ממברנות עקמומיות חיובית. אפוא, משפחת SNX-BAR יש זיקה טבעית עבור אנדוזום והוא יכול לתווך ועוד היווצרות דרך שיפוץ הממברנה שלהם יכולות. ב מבחנה, תכונות שיפוץ של SNX-ברים יכול להיגרם על ידי תוספת של מטוהרים SNX-בארים ליפוזומים סינתטיים והיווצרות בעקבות צרה, tubules מצופה יכול להיות מדמיין על ידי אלקטרון מיקרוסקופ. באמצעות שיטות אלה, החוקרים קבעו כי גם ריכוז oligomerization וכוח מכווץ להיראות להשתנות בין משפחת SNX-BAR רומז שהם יכולים לסייע הן היווצרות המספריים של ETCs.
ה-SNX-פסי יכול להיות מסווג עוד יותר על ידי מאפייני dimerization בלעדית שלהם. בעלי מבחנה מתורבת ומחקרים מבניים הוכיחו כי החלבונים SNX-BAR יכול רק ליצור הומודימרים ספציפיים או הטרודיומרס. לכן, בעיקרון, כל פוטנציאל SNX-בר dimer-oligomer יכול לספק מעיל כדורית עבור מסלול מטען ספציפי הסחר ובדומה, oligomeriטיזציה מוגבלת של אחרים SNX-BAR protomers, יכול גם להגדיר שבילים ייצוא ברורים. עם זאת, בשל המספר הגדול של SNX-ברים וגיוון בתוך משפחת SNX, מיון אחד nexin-השערת מטען אחד הוא מאוד סביר. במקום זאת מאמץ מתואם באמצעות ריבוי של גורמים כגון SNX-ברים, מטענים, ספציפיות לשומנים ויחסי תלות אחרים סביר יותר. כמו כן, מחקרים שנעשו לאחרונה של משפחת שמרים SNX4 חשף ראיות לפרטים נוספים ליפיד, מעבר ל-Dins (3) P, כדי להיות הפוטנציאל של ספקיות התחבורה6. במחקר זה, snx-BAR הומודימר Mvp1-Mvp1 היה מטוהר מן החיידקים הטרודימרים הילידים Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 ביטאו ומטוהרים בתשואה גבוהה של שמרים, בעוד Snx4-Atg20 נמצא להיות מרוצה באופן מיותר מחייב פוספוליייסרין (PS) וטופסמבנים כמו צינור צר ליפוכמה מ בעוד אחרים בשדה חשפו תכונות חשובות של snx-ברים באמצעות recombinantly מטוהרים snx-בר הומודימרס מן החיידקים, רעילות הקשורים בהבעת snx-bar הטרודימרס במערכות דומות הפריע האפיון המקורי שלהם7,8,9,10. לכן, ללא מערכת אמינה כדי להשיג recombinantly טהורה ביטא הטרודימרים הילידים, החוקרים חייבים לוותר על שורות אלה של חקירה. באיור 1, אנו מציגים זרימת עבודה ארבעה חלקים ל 1) לבנות זן שמרים להביע את הביטוי snx-BAR הטרודימרים עבור טיהור האהדה הדו, 2) מהיר ומטהר מקורי snx-BAR הטרודימרס, 3) להכין ליפוזומים unilamellar סינתטיים, ו 4) להגדיר ליפוכמה בעיות או מדידים, מתן כלי חיוני עבור חוקרים לחקור את הקטלוג הגדל של מיון nexins נמצא בטבע.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מדגימים זרימת עבודה ממוטבת כדי לטהר את SNX-בר דימרס ב שמרים ושני שאומר להעריך את המאפיינים הביופיסיים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. היתרון העיקרי על הביטוי האופייני חלבון רקומביננטי ב es, coli או מערכות אחרות היא היכולת לבטא באופן שווה את החלבונים SNX-BAR במארח יליד, ובכך הימנעות רעילו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס GM060221 ובחלקו על ידי המוסד הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים של בריאות תחת מספר הפרס T32GM007223. מ. פ. הייתה נתמכת בחלקו על ידי תוכנית המענקים למחקר של הפקולטה UNC-שארלוט.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
