出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合
Summary
ここでは、酵母におけるSNX-BARヘテロダイマーの発現、精製及びリポソーム結合のワークフローを提示する。
Abstract
SNX-BARタンパク質は、エンドサイトーシス中のタンパク質と脂質の選別と密売、エンドソーム系内での選別、オートファジーの選別に重要な役割を果たす、進化的に保存された膜改造タンパク質クラスです。SNX-BARタンパク質機能の中心は、高度に保存されたフォックス相同性(PX)およびBAR(ビン/アンフィフィシン/Rvs)ドメインを使用して膜を結合するホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する能力です。さらに、膜上のSNX-BARダイマーのオリゴマー化は膜管および小胞の形成を引き起こすことができ、この活性はエンドソーム由来輸送キャリアのコートタンパク質としての機能を反映すると考えられている。研究者は長い間、合成リポソームまたは巨大ユニラメラ小胞(GUV)上の組換えSNX-BARタンパク質を用いたインビトロ結合研究を利用して、膜リモデリングを駆動するために必要な脂質の正確な構成を明らかにし、その作用機序を明らかにしてきました。しかし、二重発現系の技術的な課題、細菌におけるSNX-BARタンパク質発現の毒性、および個々のSNX-BARタンパク質の溶解性の低下により、これまでのほとんどの研究では、細菌の発現中に形成される非生理学的二量体を含むSNX-BARホモダイマーを調べてきた。最近では、典型的な細菌発現系の大きな欠点を克服するためのプロトコルを最適化しました。このワークフローを用いて、大量のSNX-BARヘテロダイマーを正常に発現および精製する方法と、結合および管結アッセイのための合成リポソーム上でそれらを再構成する方法を示します。
Introduction
形質膜などの膜結合オルガネラは、小胞体、ゴルジ装置、リソソーム(酵母空胞)、およびエンドソームが真核細胞の内膜系を含む。ほとんどのオルガネラは、小胞輸送キャリアを介して他のオルガネラと通信し、物質を交換する能力を有する。細胞が内膜系内の小胞輸送キャリアの包装および形成をどのように調整するかをよく理解されていない。しかし、内膜系の多くを構成するタンパク質および脂質は、形質膜(PM)からの内視鏡小胞の内在化に由来することが知られている。内因性は、これらの小胞の一次アクセプターオルガネラであり、管状オルガネラの複数の相互接続されたセットで構成されています。内因性者の主な機能は、栄養獲得を促進し、タンパク質および脂質のターンオーバーを調節し、病原体感染から保護し、形質膜の脂質の主要な補充源として機能することである。内因性は、血漿膜から大量の貨物タンパク質および脂質を受け取るにつれて、貨物を管状内染色輸送キャリア(ETC)に分離することによって仕分けコンパートメントとして機能する。ETCに隔離されていないタンパク質は、エンドリソソーム系を介して分解されます。EDCに選別する貨物の調節不良は、栄養素の取り込み、タンパク質のターンオーバーまたは脂質恒常性の喪失につながり、多数の代謝、発達、および神経学的障害をもたらす1、2。しかしながら、内因性におけるEPCの中心的な役割にもかかわらず、内因性者が多数の異種貨物の包装を管状キャリアに選択的に調整する方法の根本的なメカニズムは知られていない。
選別ネキシン(SNX)ファミリーは、細胞3、4、5における多くの小胞輸送反応に重要であることが判明した進化的に保存されたタンパク質クラスである。選別ネキシンはエンドソーム膜にリクルートされ、その特徴的なフォックス相同性(PX)ドメインを介して貨物捕獲を助け、エンドソーム膜に富んだ脂質であるホスファチジルイノシトール-3-一リン酸(PtdIns(3)P)と結合する。哺乳動物は33個のSNXタンパク質をコードし、他のドメイン1の存在に応じて、さらに複数のサブファミリーに分けることができる。最も顕著なのは、SNX-BARサブファミリーはヒトで12個からなる最大のサブファミリーであり、出芽酵母ではサッカロミセス・セレビシエで、サブファミリーはわずか7 SNX-BARRに減少する。SNX-BARタンパク質は、PXドメインと、脂質貯留層を引き起して陽性曲率膜を結合するビンアンフィフィシン-RvS(BAR)ドメインの両方を有する。その結果、SNX-BARファミリーはエンドソームに対して自然な親和性を有し、膜改造能力を介してETC形成を仲介することができる。インビトロでは、SNX-BARのリモデリング特性は、合成リポソームに精製されたSNX-BARを添加し、その後の狭い、被覆管を電子顕微鏡で可視化することによって誘導することができる。これらの方法を用いて、研究者は、オリゴマー化濃度と収縮強度の両方がSNX-BARファミリーの間で異なっているように見えることを決定し、ETCの形成とサイションの両方に役立つ可能性を示唆している。
SNX-BARは、その排他的二量体化特性によってさらに分類することができる。インビトロ結合アッセイと構造研究は、SNX-BARタンパク質が特異的ホモジマーまたはヘテロダイマーのみを形成できることを実証しています。したがって、原理的には、各潜在的なSNX-BARダイマーオリゴマーは、貨物特異的な入稿経路に対してチューブルコートを提供することができ、同様に、他のSNX-BARプロトマーの制限されたオリゴマー化は、異なる輸出経路を定義することもできる。しかし、SNX-BARの数が多く、SNXファミリー内の多様性が多いため、ネキシンワン貨物仮説を選別する可能性は非常に低いです。代わりに、SNX-BAR、貨物、脂質特異性、その他の依存関係など、さまざまな要因を使用して協調的な作業を行う可能性が高くなります。同様に、酵母SNX4ファミリーの最近の研究は、PtdIns(3)Pを超えて、追加の脂質特異性の証拠を明らかにし、内染色体輸送キャリア6を増強する。本研究では、SNX-BARホモダイマーMvp1-Mvp1を細菌および天然ヘテロダイマーSnx4-Atg20およびVps5-Vps17から精製し、酵母からの高収率で発現および精製したが、Snx4-Atg20のみがホスファチジルセリン(PS)と結合する構造を優先的に結合し、唇の結合研究で狭いチューブ様構造を形成することが分かった。この分野の他の分野では、細菌由来の組換え精製SNX-BARホモダイマーを用いたSNX-BARの重要な特性を明らかにしているが、類似系でSNX-BARヘテロダイマーを発現させることに伴う毒性は、本来の特徴付けを妨げている7、8、9、10である。したがって、純粋な組換え発現天然ヘテロダイマーを得るための信頼性の高いシステムがなければ、研究者はこれらの調査ラインを見送らなければなりません。図1では、1)タンデム親和性精製のためのSNX-BARヘテロダイマーを過剰発現する酵母株を構築する4部構成のワークフローを提示し、 2)発現および精製天然SNX-BARヘテロダイマー、3)ユニラメラ合成リポソームを調製し、4)リポソームチューブまたは沈沈沈下アッセイを設定し、研究者が自然界で見つかったソートネキシンの成長カタログを調査するための重要なツールを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、酵母のSNX-BARダイマーを精製するための最適化されたワークフローと、合成リポソーム上の生物物理特性を評価する2つのアッセイを示します。大腸菌または他のシステムにおける典型的な組換えタンパク質発現に対する主な利点は、天然の宿主でSNX-BARタンパク質を均等に発現する能力であり、したがって、他のシステムにおけるSNX-BARの精製に見られる毒性および不溶性の問…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本書で報告された研究は、国立衛生研究所総合医科学研究所が受賞番号GM060221の下で、また国立研究所総合医科学研究所によって一部支援された。賞番号T32GM007223の下で健康の。R.C.はUNC-シャーロット教員研究助成プログラムの一部で支援されました。
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
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