신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합
Summary
여기서, 우리는 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정제 및 리포좀 결합에 대한 워크플로우를 제시한다.
Abstract
SNX-BAR 단백질은 내분비증 중 단백질과 지질의 분류 및 인신 매매, 내인성 시스템 내에서 선별 및 자가 포식에 중요한 역할을하는 세포 리모델링 단백질의 진화적으로 보존 된 클래스입니다. SNX-BAR 단백질 기능의 핵심은 고도로 보존된 포크스 상동성(PX) 및 BAR(빈/암피히신/Rvs) 도메인을 사용하여 멤브레인을 결합하는 호모디머 또는 이종자를 형성하는 능력입니다. 또한, 막에 SNX-BAR 이체의 올리고머는 막 tubules 및 소포의 형성을 유도할 수 있고 이 활동은 endosome 파생된 수송 운반체를 위한 외투 단백질로 그들의 기능을 반영하는 것으로 생각됩니다. 연구원은 합성 리포좀 또는 거 대 한 unilamellar 소포에 재조합 SNX-BAR 단백질을 사용 하 여 생체 외 바인딩 연구에서 오랫동안 활용 (GUVs) 막 리모델링을 구동 하는 데 필요한 지질의 정확한 메이크업을 공개, 따라서 행동의 그들의 메커니즘을 공개. 그러나, 이중 발현 시스템과 기술적 인 도전으로 인해, 박테리아에서 SNX-BAR 단백질 발현의 독성, 개별 SNX-BAR 단백질의 가난한 용해도, 현재까지 대부분의 연구는 박테리아에서 발현 중에 형성 비 생리 적 이형제를 포함하여 SNX-BAR 호모디머를 검사했다. 최근에는 일반적인 세균 발현 시스템의 주요 단점을 극복하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 이 워크플로우를 사용하여 다량의 SNX-BAR 헤테로디머를 성공적으로 표현하고 정화하는 방법과 결합 및 튜브 배관 법을 위해 합성 리포좀에서 재구성하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
혈장막, 소포체, 골지 장치, 리소좀(yeast vacuole) 및 내막과 같은 막-결합 소기관은 진핵 세포의 내막 시스템을 포함한다. 대부분의 세포기관은 소포 수송 캐리어를 통해 다른 세포기관과 통신하고 교환할 수 있습니다. 세포가 내막 시스템 내의 소포 수송 운반체의 포장 그리고 대형을 조정하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 내막 시스템의 대부분을 구성하는 단백질 및 지질은 혈장 막 (PM)에서 내분비 소포에서 유래하는 것으로 알려져 있다. endosome는 이 소포를 위한 1 차적인 수용자 소기관이고 관 성 소기관의 다중 상호 연결된 세트로 이루어져 있습니다. endosome의 주요 기능은 영양 수집을 촉진 하는, 단백질 및 지질 회전율을 조절, 병원 체 감염으로부터 보호, 플라즈마 막에 대 한 지질의 기본 보충 소스 역할을. endosome는 혈장 막에서 화물 단백질 및 지질의 대량수신으로, 관 내인체 수송 캐리어 (ETCs)로 화물을 격리해서 분류 구획으로 작동합니다. ETC로 격리되지 않은 모든 단백질은 내분비계통 시스템을 통해 분해되도록 남아 있습니다. ETC로 분류하는 화물의 역조절은 영양소 섭취, 단백질 회전율 또는 지질 항상성의 손실로 이어질 수 있으며, 이로 인해 수많은 대사, 발달 및 신경 장애1,2. 그러나, 내인성에서 ETC의 중심 역할에도 불구하고, 내인성이 관상 운반체로 이질적인 화물의 다수의 포장을 선택적으로 조정할 수 있는 방법의 근본적인 기계장치는 알려져 있지 않다.
선별된 넥신(SNX) 패밀리는 세포3,4,5에서많은 소포 수송 반응에 중요한 것으로 밝혀진 진화적으로 보존된 단백질 등급이다. 선별 넥신은 내막에 모집되고 인내막에 농축된 지질인 인산염리노시톨-3-모노포스페이트(PtdIns(3)P)를 결합하는 특징적인 인록 상동성(PX) 도메인을 통해 화물 포획을 돕습니다. 포유동물은 다른 도메인1의존재에 따라 다중 하위 패밀리로 더 분할될 수 있는 33개의 SNX 단백질을 인코딩한다. 가장 주목할 만한, SNX-BAR 하위 가족은 인간에서 열두 로 구성된 가장 큰 하위 가족이며, 신생 효모, 사카로미세세스 세레비시아에있는 동안, 하위 패밀리는 단지 7개의 SNX-BARs로 감소된다. SNX-BAR 단백질은 PX 도메인과 양성 곡률 막을 결합하는 지질 저장소를 유발하는 빈-암피히신-Rvs(BAR) 도메인을 모두 가지고 있습니다. 따라서 SNX-BAR 제품군은 내인성에 대한 자연스러운 친화력을 가지며 멤브레인 리모델링 능력을 통해 ETC 형성을 중재할 수 있습니다. 시험관내에서 SNX-BARs의 리모델링 특성은 합성 리포좀에 정제된 SNX-BARs를 첨가하여 유도될 수 있으며, 이에 따른 좁고 코팅된 튜블의 형성은 전자 현미경으로 가시화될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 연구원은 올리고머화 농도와 수축 강도 모두 그들이 ETC의 형성과 가위 모두에 도움이 될 수 제안 SNX-BAR 가족 사이에 변화하는 것으로 나타났습니다 결정했다.
SNX-BAR은 독점적인 이화 특성에 의해 추가로 분류될 수 있습니다. 시험관 내 결합 검사 및 구조 연구는 SNX-BAR 단백질이 특정 호모디머 또는 이종만 형성할 수 있음을 입증했습니다. 따라서, 원칙적으로, 각 잠재적SNX-BAR 디머-올리고머는 화물 별 인신매매 경로에 대한 튜번 코트를 제공할 수 있으며, 마찬가지로 다른 SNX-BAR 프로토머의 제한된 올리고머화는 또한 뚜렷한 수출 경로를 정의할 수 있다. 그러나 SNX 제품군 내에서 많은 수의 SNX-BARs와 다양성으로 인해 하나의 선별 된 넥신 원 화물 가설은 매우 드물다. 대신 SNX-BARs, 화물, 지질 특이성 및 기타 종속성과 같은 다양한 요인을 사용하여 조정된 노력이 더 가능성이 높습니다. 마찬가지로, 효모 SNX4 가족의 최근 연구는 PtdIns (3)P를 넘어 추가 지질 특이성에 대한 증거를 밝혀, 내분비 수송캐리어를potentiate 6. 본 연구에서, SNX-BAR 호모디머 Mvp1-Mvp1은 박테리아와 토종 이종자 Snx4-Atg20 및 Vps5-Vps17에서 정제되었으며, 효모에서 높은 수율로 정제되었으며, Snx4-Atg20만이 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS) 및 좁은 결합 구조에서 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS)을 우선적으로 결합하는 것으로나타났습니다. 현장에서 다른 사람들이 박테리아로부터 재조합 정제된 SNX-BAR 호모디머를 사용하여 SNX-BAR의 중요한 특성을 밝혀냈지만, 유사한 시스템에서 SNX-BAR 헤테로디머를 발현하는 것과 관련된 독성은 그들의 본래 특성화를 저해한7,8,9,10. 따라서 순수한 재조합으로 표현된 네이티브 헤테로디머를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 시스템이 없다면, 연구자들은 이러한 조사 라인을 포기해야 한다. 도 1에서는,우리는 탠덤 친화도 정제를 위해 SNX-BAR 헤테로디머를 과발현하는 효모 균주를 구성하기 위해 4부트 워크플로우를 제시하고, 2) 네이티브 SNX-BAR 헤테로디머를 표현하고 정화하고, 3) 단층 합성 리포솜을 준비하고, 4) 리포솜 관 또는 침전검을 설정하여 연구원들이 자연에서 발견되는 넥신을 선별하는 카탈로그를 조사하는 데 중요한 도구를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 효모와 2개의 분석에 SNX-BAR 이분무를 정화하여 합성 리포좀에 대한 생물물리학적 특성을 평가하기 위한 최적화된 워크플로우를 시연합니다. 대장균 또는 다른 시스템에서 일반적인 재조합 단백질 발현에 비해 주요 장점은 기본 숙주에서 SNX-BAR 단백질을 고르게 발현할 수 있는 능력으로, 다른 시스템에서 SNX-BARs를 정화할 때 발견되는 독성 및 불용성 문제를 피할 수 있다는 것입?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에 보고 된 연구는 수상 번호 GM060221에서 건강의 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다 그리고 부분적으로 국립 연구소의 일반 의학의 국립 연구소에 의해 수상 번호 T32GM007223에서 건강의. R.C.는 UNC-샬롯 교수 연구 보조금 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
