فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian
Summary
وتخلق الشعاب المرجانية نظما إيكولوجية للتنوع البيولوجي هامة لكل من البشر والكائنات البحرية. ومع ذلك، ما زلنا لا نفهم الإمكانات الكاملة ووظيفة العديد من الخلايا المرجانية. هنا، نقدم بروتوكولاً تم تطويره لعزل ووسم وفصل مجموعات الخلايا المرجانية الحجرية.
Abstract
الشعاب المرجانية مهددة بسبب الضغوطات البشرية المنشأ. قد تحدث الاستجابة البيولوجية للشعاب المرجانية لهذه الضغوطات على المستوى الخلوي ، ولكن الآليات غير مفهومة بشكل جيد. للتحقيق في استجابة المرجان للضغوط، نحتاج إلى أدوات لتحليل الاستجابات الخلوية. على وجه الخصوص، نحن بحاجة إلى الأدوات التي تسهل تطبيق المقالات الوظيفية لفهم أفضل لكيفية تفاعل مجموعات الخلايا مع الإجهاد. في الدراسة الحالية، نستخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين (FACS) لعزل وفصل مجموعات الخلايا المختلفة في الشعاب المرجانية الحجرية. يتضمن هذا البروتوكول: (1) فصل أنسجة المرجان عن الهيكل العظمي، (2) إنشاء تعليق خلية واحدة، (3) وضع علامات على الخلايا المرجانية باستخدام علامات مختلفة للقياس الخلوي للتدفق، و(4) استراتيجيات الجاتوز وفرز الخلايا. ستمكن هذه الطريقة الباحثين من العمل على الشعاب المرجانية على المستوى الخلوي للتحليل والمقالات الوظيفية ودراسات التعبير الجيني لمجموعات الخلايا المختلفة.
Introduction
الشعاب المرجانية هي واحدة من أهم النظم الإيكولوجية على وجه الأرض. وهي تيسر التنوع البيولوجي من خلال توفير موائل حيوية للأسماك واللافقاريات، وهي حاسمة لاستدامة المجتمعات البشرية المنشأ عن طريق توفير الغذاء وسبل العيش الاقتصادية من خلال السياحة1. كباني رئيسي للشعاب المرجانية، والحيوان المرجاني (فيلوم: Cnidaria) يساعد أيضا المجتمعات الساحلية من خلال إنشاء أطر كربونات الكالسيوم الكبيرة التي تخفف من الأضرار الناجمة عن الموجة والعواصف2.
الشعاب المرجانية كبالغين هي الحيوانات sessile التي تستضيف مجموعة واسعة من الشركاء الإندوسيفي، بما في ذلك الفيروسات، archaea، البكتيريا، البروتيين، الفطريات، وأبرزها، أعضاء الأسرة اللادغالي dinoflagellate سيمبيدياسي3. يمكن أن تسبب التغيرات في البيئة اختلالات في هذا المجتمع، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى تفشي الأمراض وتبييض المرجان حيث يتم طرد السيمبيدياسية التكافلية من مستعمرة المرجان، وبالتالي القضاء على المصدر الرئيسي للتغذية للشعاب المرجانية. كل من هذه السيناريوهات غالبا ما يسبب وفاة المضيف المرجان4,5,6. وتؤدي آثار الضغوط اتّسبة من صنع الإنسان، مثل التغير المناخي السريع، إلى تسريع أحداث موت المرجان الجماعي، مما يؤدي إلى انخفاض عالمي في عدد الشعاب المرجانية7.
وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من الطرق المختلفة للمساعدة في التخفيف من فقدان الشعاب المرجانية. وتشمل هذه الأساليب زراعة الشعاب المرجانية على الشعاب المرجانية القائمة، والعبور الجيني باستخدام الأنماط الجينية المتسامحة حراريا، والتلاعب الخلوي بالمجتمعات الميكروبية والتكافلية المستضافة داخل المرجان8،,9. على الرغم من هذه الجهود، لا يزال الكثير غير معروف حول تنوع الخلايا المرجانية وظيفة الخلية10،11،12،13. من الضروري فهم شامل لتنوع نوع الخلايا المرجانية ووظيفة الخلية لفهم كيفية تعامل الكائن المرجاني في ظل ظروف معيارية ومرهقة. وستستفيد الجهود الرامية إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة في الترميم والحفظ من تعزيز فهم كيفية اقتران تنوع الخلايا ووظيفة الجينات.
وقد ركز العمل السابق على تنوع الخلايا ووظيفتها في المقام الأول على الدراسات النسيجية والأنسجة الكاملة الحمض النووي الريبي أخذ العينات14،15،16،17. للحصول على مزيد من التفاصيل حول وظيفة نوع خلية محددة في الشعاب المرجانية ، يجب أن تكون هناك طرق لعزل مجموعات محددة من خلايا المرجان الحية. وقد تم ذلك بنجاح في الكائنات الحية النموذج غير الكلاسيكي عن طريق فرز الخلايا المنشطة فلورسينس (FACS) تدفق تكنولوجيا القياس الخلوي18. يستخدم FACS مزيجًا من الليزر الذي يتم ضبطه على أطوال موجية مختلفة لقياس الخصائص الخلوية الذاتية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة مثل حجم الخلية النسبية وحبيبات الخلية والفلورسب. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم وضع علامة على الخلايا بواسطة مركبات تحمل علامة فلورية لقياس خصائص محددة ومطلوبة18،19.
حتى الآن، وتطبيق تدفق قياس الخلايا الخلايا المرجانية كان أساسا لتحليل سيمبيانياسيا تكافلي وغيرها من السكان البكتيرية من خلال الاستفادة من الفلور الفلورالطبيعية القوية20،21،22. كما استُخدم نظام مراقبة الشعاب المرجانية لتقدير حجم الجينوم المرجاني باستخدام إشارة علامة الحمض النووي الفلورية مقارنة بخلايا الكائنات الحية النموذجية المرجعية23،,24. ويوفر التطبيق الفعال للنظام الميداني للخلايا الدقيقة ثلاث أدوات متميزة مفيدة لدراسات بيولوجيا الخلايا: 1) الوصف المورفولوجي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة 2) تحديد وفصل وعزل مجموعات خلايا محددة لدراسات المصب؛ و 3) تحليل المقالات الوظيفية على مستوى الخلية الواحدة.
ولا يزال تطوير وتطبيق مختلف العلامات الفلورية الخارجية لدراسة الخلايا المرجانية غير مستكشفتقريبا. قد تتضمن هذه العلامات البروتينات الموسومة، أو ركائز الموسومة للإنزيمات، أو استجابات الفلورسنت للمركبات الأخرى. يمكن استخدام هذه العلامات لتحديد أنواع الخلايا التي لها خصائص فريدة، مثل تمييز الخلايا التي تنتج كميات مختلفة من ميزة مقصورة خلوية محددة، مثل الليسوسوماس. مثال إضافي هو استخدام الخرز المسمى الفلورسنت لتحديد وظيفيا الخلايا المختصة لبلع، أو ابتلاع مسببات الأمراض المستهدفة25. ويمكن بسهولة تحديد مجموعات الخلايا النشطة في استجابات المناعة من قبل FACS بعد ابتلاع هذه الخرز المطبقة خارجيًا. في حين تتطلب الطرق النسيجية التقليدية الأنسجة المحفوظة وساعات عديدة لتقريب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لابتلاع النحل ، يمكن إجراء فحص وظيفي قائم على FACS لابتلاع مسببات الأمراض بسرعة نسبية على الخلايا الحية المعزولة. بالإضافة إلى دراسة الاستجابات الخاصة بالخلايا للإجهاد ، فإن هذه التكنولوجيا لديها القدرة على توضيح التعبير الخاص بالجينات وإلقاء الضوء على التاريخ التطوري والتنموي لأنواع الخلايا الفريدة تمامًا للcnidarians ، مثل الكاليكوبلاس والخلايا العصبية.
في الآونة الأخيرة، قمنا بإجراء فحص مكثف لأكثر من 30 علامة خلوية أسفرت عن تحديد 24 علامة قادرة على وضع علامات على الخلايا المرجانية، 16 منها مفيدة للتمييز بين السكان الفريدين18،مما يجعلها مجموعات من التمايز (CD). هنا نحن وصف عملية عزل الخلايا المرجانية في البوتشيبوروا داميكورنيس من إزالة الخلايا من الهيكل العظمي كربونات الكالسيوم إلى تحديد وعزل مجموعات خلايا محددة مع FACS(الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تكييف هذا البروتوكول من Rosental et al.18 وتم تطويره لتحديد وعزل خلايا P. damicornis. وتركز المنهجية على عملية تصفية العينات لإزالة الحطام والخلايا غير القابلة للحياة والخلايا المستضافة من قبل السيمبيدياسية من خلال فحص العوامل الجوهرية للخلية، بما في ذلك حجم الخلية النسبي، وحبيب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتود NTK أن تعترف بجوائز جامعة ميامي للأبحاث في العلوم الطبيعية والهندسة لتمويلها هذا البحث. BR تود أن تشكر أليكس وآن لاوترباخ لتمويل مختبر المناعة المقارنة والتطورية. تم دعم عمل BR من قبل أرقام مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF): 1416/19 و 2841/19، ومنحة أبحاث HFSP، RGY0085/2019. ونود أن نشكر زانا كوزهيكباييفا ومايك كونيلي على المساعدة التقنية. ونود أيضا أن نشكر جامعة ميامي، وكلية ميلر للطب تدفق الموارد المشتركة في مركز سيلفستر الشامل للسرطان للوصول إلى مقياس الخلايا FACS وشانون صايغ للدعم التقني.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
