Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane

Summary

I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l’uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l’isolamento, l’etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.

Abstract

Le barriere coralline sono minacciate da fattori di stress antropogenici. La risposta biologica del corallo a questi fattori di stress può verificarsi a livello cellulare, ma i meccanismi non sono ben compresi. Per studiare la risposta dei coralli ai fattori di stress, abbiamo bisogno di strumenti per analizzare le risposte cellulari. In particolare, abbiamo bisogno di strumenti che facilitino l’applicazione di saggi funzionali per capire meglio come le popolazioni cellulari reagiscono allo stress. Nello studio attuale, utilizziamo lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare e separare diverse popolazioni di cellule nei coralli rocciosi. Questo protocollo comprende: (1) la separazione dei tessuti del corallo dallo scheletro, (2) la creazione di una sospensione a singola cella, (3) l’etichettatura delle cellule coralline utilizzando vari marcatori per la citometria di flusso e (4) strategie di gating e smistamento delle cellule. Questo metodo consentirà ai ricercatori di lavorare sui coralli a livello cellulare per analisi, analisi funzionali e studi sull’espressione genica di diverse popolazioni di cellule.

Introduction

Le barriere coralline sono uno degli ecosistemi più importanti della Terra. Facilitano la biodiversità fornendo habitat critici per pesci e invertebrati e sono fondamentali per sostenere le comunità antropogeniche fornendo cibo e sostentamento economico attraverso il turismo¹. In qualità di costruttore chiave di barriere coralline, l’animale corallo (Phylum: Cnidaria) aiuta anche le comunità costiere creando grandi quadri di carbonato di calcio che mitigano i danni delle onde e delle tempeste².

I coralli come adulti sono animali sessili che ospitano una vasta gamma di partner endosimbiotici, tra cui virus, archea, batteri, protisti, funghi, e, in particolare, i membri della famiglia dinoflagellate algalellate Symbiodiniaceae³. I cambiamenti nell’ambiente possono causare squilibri in questa comunità, spesso portando a focolai di malattia e sbiancamento dei coralli in cui le simbiotiche Symbiodiniaceae vengono espulse dalla colonia del corallo, eliminando così la principale fonte di nutrizione per il corallo. Entrambi questi scenari spesso causano la morte dell’ospite corallo^4,5,6. Gli effetti dei fattori di stress antropogenici, come il rapido cambiamento climatico, stanno accelerando gli eventi di morte dei coralli di massa, portando ad un declino globale delle barriere coralline^{7 .}

Recentemente, sono stati sviluppati molti metodi diversiper contribuire a mitigare la perdita della barriera corallina. Questi metodi includonollo posizionamento di coralli sulle barriere coralline esistenti, attraversamento genetico con genotipi termalmente tolleranti e manipolazione cellulare delle comunità microbiche e simbiotiche ospitate all’interno del corallo^8,9. Nonostante questi sforzi, molto rimane sconosciuto sulla diversità delle cellule coralline e la funzione cellulare^10,11,12,13. Una comprensione approfondita della diversità del tipo di cellule coralline e della funzione cellulare è necessaria per capire come l’organismo corallo si comporta in condizioni normative e stressanti. Gli sforzi per massimizzare l’efficienza del ripristino e della conservazione beneficeranno di una migliore comprensione del modo in cui la diversità cellulare e la funzione genica sono accoppiate.

Precedenti lavori sulla diversità e la funzione cellulare si sono concentrati principalmente sugli studi istologici e sul campionamento dell’RNA a tutto tessuto^14,15,16,17. Per ottenere maggiori dettagli sulla funzione specifica del tipo di cellula nei coralli, ci devono essere metodi per l’isolamento di specifiche popolazioni di cellule coralline vive. Questo è stato fatto con successo in organismi modello non classici per mezzo di fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tecnologia di citometria di flusso¹⁸. FACS utilizza una combinazione di laser sintonizzati su lunghezze d’onda variabili per misurare diverse proprietà cellulari endogene a livello di singola cellula, come la dimensione relativa delle cellule, la granularità cellulare e l’autofluorescenza. Inoltre, le cellule possono essere contrassegnate da composti fluorescenti etichettati per misurare specifiche proprietà desiderate^18,19.

Finora, l’applicazione della citometria di flusso alle cellule coralline è stata principalmente per l’analisi di Symbiodiniaceae simbiotica e altre popolazioni batteriche utilizzando la loro forte, naturale autofluorescenza^20,21,22. FACS è stato utilizzato anche per stimare le dimensioni del genoma del corallo utilizzando il segnale marcatore del DNA fluorescente rispetto alle cellule dell’organismo modello di riferimento^23,24. L’applicazione efficiente del FACS fornisce tre strumenti distinti che sono utili per gli studi di biologia cellulare: 1) descrizione morfologica e funzionale delle singole cellule; 2) identificazione, separazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule per studi a valle; e 3) l’analisi dei saggi funzionali a livello di singola cellula.

Lo sviluppo e l’applicazione di vari marcatori fluorescenti esogeni per lo studio delle cellule coralline rimane quasi inesplorato. Tali marcatori possono includere proteine taggate, substrati marcati per enzimi o risposte fluorescenti ad altri composti. Questi marcatori possono essere utilizzati per identificare i tipi di cellule che hanno proprietà uniche, come l’evidenziazione di celle che producono quantità variabili di una specifica funzione di raggruppamento cellulare, come i lisosomi. Un ulteriore esempio è l’uso di perline etichettate fluorescentmente per identificare funzionalmente le cellule competenti per la fagocitosi, o l’inghiottimento di un agente patogeno mirato²⁵. Le popolazioni di cellule attive nelle risposte immunitarie possono essere facilmente identificate dalla FACS dopo l’inghiottimento di queste perline applicate esogenamente. Mentre i metodi istologici tradizionali richiedono tessuto conservato e molte ore per approssimare la percentuale di cellule positive per l’inghiottimento del tallone, un saggio funzionale basato su FACS per l’inghiottimento degli agenti patogeni può essere eseguito relativamente rapidamente su cellule vive isolate. Oltre a studiare le risposte specifiche delle cellule allo stress, questa tecnologia ha il potenziale per chiarire l’espressione gene-specifica e illuminare la storia evolutiva e evolutiva dei tipi di cellule interamente unica per i cnidariani, come i calicoblasti e i cnidociti.

Recentemente, abbiamo eseguito uno screening intensivo di oltre 30 marcatori cellulari che ha portato all’identificazione di 24 che sono in grado di etichettare le cellule coralline, 16 delle quali sono utili per distinguere le popolazioni uniche¹⁸, rendendole cluster di differenziazione (CD). Qui descriviamo il processo di isolamento delle cellule coralline in Pocillopora damicornis dalla rimozione delle cellule dallo scheletro di carbonato di calcio all’identificazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule con FACS (Figura 1).

Protocol

1. Dissociazione dei tessuti dallo scheletro del corallo tramite aerografo e compressore NOTA: Eseguire passi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti. Assemblare il kit dell’aerografo collegando il compressore d’aria, il tubo flessibile e l’aerografo (Figura 2). Impostare l’indicatore di pressione tra 276-483 kPa.NOTA: Il compressore e il tubo dell’aria consigliati utilizzati per questo studio sono stati preimpostati a una pressione massima di…

Representative Results

Nel complesso, questo protocollo è utile perché facilita l’identificazione e la raccolta delle popolazioni di cellule coralline vive che possono essere utilizzate per analisi funzionali. Il flusso di lavoro è iniziato con la separazione meccanica dei tessuti corallini dallo scheletro di carbonato di calcio sottostante (Figura 1). Questo è uno dei passi iniziali più importanti perché tecnica impropria si traduce in alta mortalità cellulare e può creare…

Discussion

Questo protocollo è stato adattato da Rosental et al.¹⁸ e sviluppato per l’identificazione e l’isolamento delle cellule di P. damicornis. La metodologia si concentra sul processo di filtraggio dei campioni per rimuovere detriti, cellule non vitali e cellule ospitate da Symbiodiniaceae attraverso l’esame di fattori intrinseci cellulari, tra cui la dimensione delle cellule relative, la granularità relativa delle cellule, l’autofluorescenza cellulare e la presenza di membrane cellulari int…

Materials

Airbrush Kit & Compressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria II	BD	644832
Bone Cutters	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm
Collection bag	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemacytometer
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294	1.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
Round-bottom tubes	VWR	352063	5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube
Syringe	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate