Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas
Summary
Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.
Abstract
Los arrecifes de coral están amenazados debido a factores de estrés antropogénicos. La respuesta biológica del coral a estos factores estresantes puede ocurrir a nivel celular, pero los mecanismos no se entienden bien. Para investigar la respuesta coralina a los factores estresantes, necesitamos herramientas para analizar las respuestas celulares. En particular, necesitamos herramientas que faciliten la aplicación de ensayos funcionales para comprender mejor cómo reaccionan las poblaciones celulares al estrés. En el estudio actual, utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y separar diferentes poblaciones celulares en corales pedregosos. Este protocolo incluye: (1) la separación de los tejidos corales del esqueleto, (2) la creación de una suspensión de una sola célula, (3) el etiquetado de las células de coral utilizando varios marcadores para la citometría de flujo, y (4) gating y estrategias de clasificación celular. Este método permitirá a los investigadores trabajar en corales a nivel celular para análisis, ensayos funcionales y estudios de expresión génica de diferentes poblaciones celulares.
Introduction
Los arrecifes de coral son uno de los ecosistemas más importantes de la Tierra. Facilitan la biodiversidad proporcionando hábitats críticos para los peces y los invertebrados y son cruciales para sostener las comunidades antropogénicas proporcionando alimentos y medios de vida económicos a través del turismo1. Como el constructor clave de los arrecifes de coral, el animal de coral (Phylum: Cnidaria) también ayuda a las comunidades costeras mediante la creación de grandes marcos de carbonato de calcio que mitigan los daños causados por las olas y las tormentas2.
Los corales como adultos son animales sésiles que albergan una amplia gama de socios endosímbióticos, incluyendo virus, arqueas, bacterias, protistas, hongos, y más notablemente, miembros de la familia de dinoflagelados de algas Symbiodiniaceae3. Los cambios en el medio ambiente pueden causar desequilibrios en esta comunidad, a menudo dando lugar a brotes de enfermedades y blanqueo de corales en los que las Simbióticas Symbiodiniaceae son expulsadas de la colonia de coral, eliminando así la principal fuente de nutrición para el coral. Ambos escenarios a menudo causan la muerte del huésped de coral4,5,6. Los efectos de los factores estresantes inducidos por antropogénicos, como el rápido cambio climático, están acelerando los eventos masivos de muerte de coral, lo que conduce a un declive global de los arrecifes de coral7.
Recientemente, se han desarrollado muchos métodos diferentes para ayudar a mitigar la pérdida de arrecifes de coral. Estos métodos incluyen la desplantación de corales en arrecifes existentes, el cruce genético utilizando genotipos térmicamente tolerantes, y la manipulación celular de las comunidades microbianas y simbióticas alojadas dentro del coral8,,9. A pesar de estos esfuerzos, mucho sigue siendo desconocido sobre la diversidad de células de coral y la función celular10,11,12,13. Una comprensión profunda de la diversidad del tipo de células de coral y la función celular es necesaria para entender cómo el organismo coralino se comporta bajo condiciones normativas y estresantes. Los esfuerzos para maximizar la restauración y la eficiencia de la preservación se beneficiarán de una mejor comprensión de cómo se acoplan la diversidad celular y la función génica.
Los trabajos previos sobre diversidad y función celular se han centrado principalmente en estudios histológicos y muestreo de ARN de tejido entero14,15,16,17. Para obtener más detalles sobre la función de tipo celular específico en los corales, es necesario que existan métodos para el aislamiento de poblaciones específicas de células coralinas vivas. Esto se ha hecho con éxito en organismos modelo noclónicos mediante la tecnología de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)18. FACS utiliza una combinación de láseres sintonizados con diferentes longitudes de onda para medir diferentes propiedades celulares endógenas a nivel de celda única, como el tamaño relativo de la célula, la granularidad celular y la autofluorescencia. Además, las células pueden estar marcadas por compuestos con etiqueta fluorescente para medir las propiedades específicas deseadas18,19.
Hasta ahora, la aplicación de la citometría de flujo a las células de coral ha sido principalmente para el análisis de Symbiodiniaceae simbióticas y otras poblaciones bacterianas mediante la utilización de su fuerte autofluorescencia natural20,,21,22. FACS también se ha utilizado para estimar el tamaño del genoma del coral mediante el uso de señal marcador de ADN fluorescente en comparación con las células del organismo modelo de referencia23,24. La aplicación eficiente de FACS proporciona tres herramientas distintas que son útiles para los estudios de biología celular: 1) descripción morfológica y funcional de células individuales; 2) identificación, separación y aislamiento de poblaciones celulares específicas para estudios posteriores; y 3) el análisis de ensayos funcionales a nivel de célula única.
El desarrollo y aplicación de varios marcadores fluorescentes exógenos para el estudio de las células de coral sigue siendo casi inexplorado. Tales marcadores pueden incluir proteínas etiquetadas, sustratos etiquetados para enzimas o respuestas fluorescentes a otros compuestos. Estos marcadores se pueden utilizar para identificar tipos de celdas que tienen propiedades únicas, como resaltar celdas que producen cantidades variables de una característica de compartimiento celular específica, como los lisosomas. Un ejemplo adicional es el uso de perlas con etiqueta fluorescente para identificar funcionalmente las células competentes para la fagocitosis, o el engullimiento de un patógeno objetivo25. Las poblaciones de células activas en las respuestas de inmunidad pueden ser fácilmente identificadas por el FACS después del engullimiento de estas cuentas aplicadas exógenamente. Mientras que los métodos histológicos tradicionales requieren tejido preservado y muchas horas para aproximar el porcentaje de células positivas para el engullimiento de las cuentas, un ensayo funcional basado en FACS para el engullido patógeno se puede realizar relativamente rápidamente en células vivas aisladas. Además de estudiar las respuestas específicas de las células al estrés, esta tecnología tiene el potencial de aclarar la expresión específica del gen e iluminar la historia evolutiva y de desarrollo de tipos celulares totalmente únicos de los cnidarios, como calicoblastos y cnidocitos.
Recientemente, realizamos un cribado intensivo de más de 30 marcadores celulares que resultó en identificar 24 que son capaces de etiquetar células de coral, 16 de las cuales son útiles para distinguir poblaciones únicas18,convirtiéndolas en grupos de diferenciación (CD). Aquí describimos el proceso de aislamiento de células de coral en Pocillopora damicornis de la eliminación de células del esqueleto de carbonato de calcio hasta la identificación y aislamiento de poblaciones celulares específicas con FACS (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fue adaptado de Rosental et al.18 y desarrollado para la identificación y aislamiento de células P. damicornis. La metodología se centra en el proceso de filtrado de muestras para eliminar desechos, células no viables y células alojadas en Symbiodiniaceae a través del examen de factores intrínsecos celulares, incluyendo el tamaño relativo de la célula, la granularidad relativa de las células, la autofluorescencia celular y la presencia de membranas celulares intac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK desea reconocer los Premios de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de la Universidad de Miami por financiar esta investigación. BR desea agradecer a Alex y Ann Lauterbach por financiar el Laboratorio de Inmunología Comparativa y Evolutiva. El trabajo de la BR fue apoyado por los números de la Fundación Israel Science (ISF): 1416/19 y 2841/19, y HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nos gustaría dar las gracias a Zhanna Kozhekbaeva y Mike Connelly por la asistencia técnica. También nos gustaría agradecer al Recurso Compartido de Citometría de Flujo de la Universidad de Miami, Miller School of Medicine en el Sylvester Comprehensive Cancer Center por el acceso al citometro FACS y a Shannon Saigh por apoyo técnico.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
