स्लेरेक्टिनियन सेल आबादी के अलगाव के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई
Summary
कोरल मनुष्यों और समुद्री जीवों दोनों के लिए महत्वपूर्ण जैव विविध पारिस्थितिकी तंत्र बनाते हैं। हालांकि, हम अभी भी कई कोरल कोशिकाओं की पूरी क्षमता और कार्य को नहीं समझते हैं। यहां, हम पथरीले कोरल सेल आबादी के अलगाव, लेबलिंग और पृथक्करण के लिए विकसित एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
मानवजनित तनाव के कारण प्रवाल भित्तियों को खतरा है। इन तनावों के लिए कोरल की जैविक प्रतिक्रिया सेलुलर स्तर पर हो सकती है, लेकिन तंत्र को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। तनाव के लिए कोरल प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, हम सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए उपकरणों की जरूरत है । विशेष रूप से, हम उपकरण है कि कार्यात्मक परख के आवेदन की सुविधा को बेहतर समझने की कैसे सेल आबादी तनाव पर प्रतिक्रिया कर रहे है की जरूरत है । वर्तमान अध्ययन में, हम पथरीले कोरल में विभिन्न सेल आबादी को अलग करने और अलग करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करते हैं। इस प्रोटोकॉल में शामिल हैं: (1) कंकाल से कोरल ऊतकों का पृथक्करण, (2) एक सेल निलंबन का निर्माण, (3) प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विभिन्न मार्कर का उपयोग करके कोरल कोशिकाओं को लेबल करना, और (4) गेटिंग और सेल छंटाई रणनीतियां। इस विधि शोधकर्ताओं को विश्लेषण, कार्यात्मक परख, और विभिन्न सेल आबादी के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए सेलुलर स्तर पर कोरल पर काम करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।
Introduction
प्रवाल भित्तियां पृथ्वी पर सबसे महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी प्रणालियों में से एक हैं। वे मछली और अकशेरुकी के लिए महत्वपूर्ण आवास प्रदान करके जैव विविधता को सुगम बनाते हैं और पर्यटनकेमाध्यम से भोजन और आर्थिक आजीविका प्रदान करके मानवजनित समुदायों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । प्रवाल भित्तियों के प्रमुख निर्माता के रूप में, कोरल पशु (फिलम: Cnidaria) भी बड़े कैल्शियम कार्बोनेट चौखटे है कि लहर और तूफान क्षति2को कम बनाने के द्वारा तटीय समुदायों एड्स ।
वयस्कों के रूप में कोरल सेसिले जानवर हैं जो वायरस, आर्काया, बैक्टीरिया, प्रोटिस्ट, कवक और सबसे विशेष रूप से, शैवाल डिनोफ्लेलेट परिवार के सदस्यों सहित एंडोसिम्बिक भागीदारों की एक विस्तृत सरणी की मेजबानी करतेहैं। पर्यावरण में परिवर्तन इस समुदाय में असंतुलन पैदा कर सकता है, अक्सर रोग फैलने और कोरल ब्लीचिंग का कारण बनता है जिसमें सहजीवी सिम्बायोडिनेसी को कोरल कॉलोनी से निष्कासित कर दिया जाता है, इस प्रकार कोरल के लिए पोषण के प्रमुख स्रोत को नष्ट कर देता है। ये दोनों परिदृश्य अक्सर मूंगा मेजबान4,5,6की मृत्यु का कारण बनते हैं . मानवजनित प्रेरित तनावों के प्रभाव, जैसे कि तेजी से जलवायु परिवर्तन, बड़े पैमाने पर प्रवाल मृत्यु की घटनाओं में तेजी ला रहे हैं, जिससे प्रवाल भित्तियों की वैश्विक गिरावट7है ।
हाल ही में, प्रवाल चट्टान के नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए कई अलग-अलग तरीके विकसित किए गए हैं। इन तरीकों में मौजूदा भित्तियों पर कोरल का रोपण, थर्मल सहिष्णु जीनोटाइप का उपयोग करके आनुवंशिक क्रॉसिंग, और कोरल8,,9के भीतर आयोजित माइक्रोबियल और सहजीवी समुदायों में सेलुलर हेरफेर शामिल हैं। इन प्रयासों के बावजूद, कोरल सेल विविधता और सेल फ़ंक्शन10,11 ,12,,1313के बारे में बहुत कुछ अज्ञात है। कोरल सेल प्रकार विविधता और सेल फ़ंक्शन की पूरी समझ यह समझने के लिए आवश्यक है कि प्रवाल जीव मानक और तनावपूर्ण परिस्थितियों में कैसे व्यवहार करता है। बहाली और संरक्षण दक्षता को अधिकतम करने के प्रयासों को कैसे सेल विविधता और जीन समारोह युग्मित कर रहे है की एक बढ़ाया समझ से लाभ होगा ।
सेल विविधता और कार्य पर पिछला कार्य मुख्य रूप से हिस्टोलॉजिकल अध्ययन और पूरे ऊतक आरएनए नमूने14,15,1616,17पर केंद्रित है । कोरल में विशिष्ट सेल प्रकार समारोह पर अधिक से अधिक विस्तार प्राप्त करने के लिए, लाइव कोरल कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी के अलगाव के लिए तरीके होने की आवश्यकता है। यह फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) प्रवाह साइटोमेट्री प्रौद्योगिकी18के माध्यम से गैर-शास्त्रीय मॉडल जीवों में सफलतापूर्वक किया गया है। FACS एकल कोशिका स्तर पर विभिन्न एंडोजेनस सेलुलर गुणों जैसे सापेक्ष कोशिका आकार, सेल दानेदारता और ऑटोफ्लोरेसेंस को मापने के लिए अलग-अलग तरंगदैर्ध्य को देखते लेजर के संयोजन का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को विशिष्ट, वांछित गुणों को मापने के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल यौगिकों द्वारा चिह्नित किया जा सकता है18,,19।
इस प्रकार अब तक, कोरल कोशिकाओं में प्रवाह साइटोमेट्री का अनुप्रयोग मुख्य रूप से अपने मजबूत, प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस20,,21,,22का उपयोग करके सहजीवी सिम्बायोडिनेसी और अन्य जीवाणु आबादी के विश्लेषण के लिए किया गया है। रेफरेंस मॉडल ऑर्गेज्म कोशिकाओं23,24की तुलना में फ्लोरोसेंट डीएनए मार्कर सिग्नल का उपयोग करके प्रवाल जीनोम आकार का अनुमान लगाने के लिए एफएसीएस का भी उपयोग किया गया है । FACS का कुशल अनुप्रयोग तीन अलग-अलग उपकरण प्रदान करता है जो सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उपयोगी हैं: 1) एकल कोशिकाओं का रूपात्मक और कार्यात्मक विवरण; 2) डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए विशिष्ट सेल आबादी की पहचान, अलगाव और अलगाव; और 3) एकल कोशिका स्तर पर कार्यात्मक परखों का विश्लेषण।
कोरल कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विभिन्न एक्सोजेनस फ्लोरोसेंट मार्कर का विकास और अनुप्रयोग लगभग बेरोज़गार रहता है। इस तरह के मार्कर में टैग किए गए प्रोटीन, एंजाइमों के लिए टैग किए गए सब्सट्रेट्स, या अन्य यौगिकों के लिए फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकती हैं। इन मार्कर का उपयोग उन कोशिका ओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिनमें अद्वितीय गुण होते हैं, जैसे कि कोशिकाओं को हाइलाइट करना जो एक विशिष्ट सेलुलर डिब्बे सुविधा की अलग-अलग मात्रा का उत्पादन करते हैं, जैसे लिसोसोम्स। एक अतिरिक्त उदाहरण फ्लोरोसेंटी लेबल वाले मोतियों का उपयोग है ताकि फैगोसाइटोसिस के लिए सक्षम कोशिकाओं की कार्यात्मक पहचान की जा सके, या लक्षित रोगजनक25की चपेट में आ जाए। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सक्रिय कोशिकाओं की आबादी को इन बहिर्जात रूप से लागू मोतियों की चपेट में आने के बाद FACS द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। जबकि पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तरीकों को संरक्षित ऊतक और कई घंटों की आवश्यकता होती है जो मनका छाहट के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान लगाते हैं, रोगजनक छाई के लिए एक FACS आधारित कार्यात्मक परख को अलग-अलग जीवित कोशिकाओं पर अपेक्षाकृत जल्दी किया जा सकता है। तनाव के लिए सेल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के अलावा, इस तकनीक में जीन-विशिष्ट अभिव्यक्ति को स्पष्ट करने और कोशिका प्रकारों के विकासवादी और विकासात्मक इतिहास को पूरी तरह से सीनिडिएरियन के लिए अद्वितीय रोशन करने की क्षमता है, जैसे कैलिकोब्लास्ट और सीनिडोसाइट्स।
हाल ही में, हमने 30 से अधिक सेलुलर मार्कर की गहन स्क्रीनिंग की, जिसके परिणामस्वरूप 24 की पहचान की गई जो कोरल कोशिकाओं को लेबल करने में सक्षम हैं, जिनमें से 16 अद्वितीय आबादी18को अलग करने के लिए उपयोगी हैं, जिससे उन्हें भेदभाव (सीडी) के समूह बना रहे हैं। यहां हम कैल्शियम कार्बोनेट कंकाल से कोशिकाओं को हटाने से लेकर एफएसीएस(चित्रा 1)के साथ विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान और अलगाव तक पोसिललोपोरा डैमिकॉर्निस में कोरल सेल अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल को रोसेनटाल एट अल18 से अनुकूलित किया गया था और पी डेमियाकॉर्निस कोशिकाओं की पहचान और अलगाव के लिए विकसित किया गया था। कार्यप्रणाली मलबे, अव्यवहार्य कोशिकाओं, और सिम्बायोडिनिय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनटीके इस शोध के वित्तपोषण के लिए प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग में मियामी अनुसंधान पुरस्कार विश्वविद्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं । बीआर तुलनात्मक और विकासवादी इम्यूनोलॉजी प्रयोगशाला के वित्तपोषण के लिए एलेक्स और ऐन लॉटरबाख का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । बीआर के काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ) संख्या: 1416/19 और 2841/19, और एचएफएसपी रिसर्च ग्रांट, आरजीवाई0085/2019 द्वारा समर्थित किया गया था। हम तकनीकी सहायता के लिए झन्ना कोजेकबावा और माइक कोनेली का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम भी मियामी विश्वविद्यालय, मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन के फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सिल्वेस्टर व्यापक कैंसर केंद्र में FACS साइटोमीटर के लिए उपयोग के लिए और तकनीकी सहायता के लिए शांनोन Saigh के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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