Kultur af små koloni variant af Pseudomonas aeruginosa og kvantificering af sin Alginat
Summary
Her beskriver vi en vækst betingelse for at kultur den lille koloni variant af Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder til påvisning og kvantificering af exopolysaccharid alginat produceret af P. aeruginosa ved hjælp af en traditionel uroonsyre carbazole assay og en alginat-specifik monoklonal antistof (mAb) baseret ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriel patogen, kan overproducere en exopolysaccharide alginat resulterer i en unik fænotype kaldet mucoidy. Alginat er forbundet med kroniske lungeinfektioner resulterer i dårlig prognose hos patienter med cystisk fibrose (CF). Forståelse af de veje, der regulerer produktionen af alginat kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske strategier rettet mod alginat dannelse. En anden sygdomsrelateret fænotype er den lille kolonivariant (SCV). SCV skyldes den langsomme vækst af bakterier og ofte forbundet med øget resistens over for antimikrobielle stoffer. I dette papir viser vi først en metode til dyrkning af en genetisk defineret form for P. aeruginosa SCV på grund af pyrimidinbiosyntesemutationer. Tilskud af kvælstofholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale vækst til disse mutanter, der viser tilstedeværelsen af en bjærgningvej, der skyller fri baser fra miljøet. Dernæst diskuterer vi to metoder til måling af bakteriel alginat. Den første metode bygger på hydrolyse af polysaccharid til sin uronsyre monomer efterfulgt af fraivatisering med et kromogtisk reagens, carbazole, mens den anden metode anvender en ELISA baseret på en kommercielt tilgængelig, alginat-specifikke mAb. Begge metoder kræver en standardkurve for kvantificering. Vi viser også, at den immunologiske metode er specifik for alginatkvificering og kan anvendes til måling af alginat i de kliniske prøver.
Introduction
Kroniske lungeinfektioner med Pseudomonas aeruginosa er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed hos patienter med cystisk fibrose (CF). I den tidlige barndom, patienter er koloniseret af flere bakterielle patogener herunder nonmucoid isolater af P. aeruginosa1,2. Fremkomsten af den lille koloni variant (SCV) isolater samt mucoid isolater er en markør for debut til kroniske infektioner. SCV isolater er meget resistente3 på grund af deres langsomme vækstrater4, hvilket gør dem en alvorlig afskrækkende i behandlingen regimenter og andre kroniske infektioner5 af P. aeruginosa. Arbejde af Al Ahmar et al.6 viste en sammenhæng mellem SCV og slimhinde forbundet med de novo pyrimidin biosyntese. Pyrimidinsult, på grund af mutationer i gener involveret i pyrimidinproduktion, resulterede i SCV fænotype i nonmucoid referencestammen PAO1 og mucoid derivat, PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduktion er en vigtig sygdommarkør for kroniske lungeinfektioner i CF, er det ikke klart, om der er en direkte sammenhæng mellem mængden af alginat og lungepatologi, og det er uklart, om alginat kan bruges som prognosemarkør til behandling7. Alginatproduktionen reguleres hovedsagelig af to operoner, en regulerende operon (algUmucABCD)8,9 og den biosyntetiske operon(algD operon)10,11. Alginatproduktionen reguleres stramt af sigmafaktoren AlgU9,12 (også kendt som AlgT) og nedbrydningen af antisigmafaktoren MucA13. Evnen til at overvåge produktionen af alginat in situ fra patienternes spytprøver kan hjælpe med udviklingen af nye terapeutiske muligheder.
Her beskriver vi en væksttilstand, der registrerer tilstedeværelsen af SCV forårsaget af mutanter, der ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskud af uracil og/eller cytosin, den nitrogenholdige base af pyrimidin nukleotid, til mediet aktiverer bjærgning vej, og dermed genoprette den normale vækst i mutanter. Denne vækstmetode for disse specifikke SCV-mutanter kan anvendes som screeningsmetode til at identificere pyrimidinmutationer i patientprøver. Derudover diskuterer vi to metoder til påvisning og måling af alginat produceret og udskilles af P. aeruginosa. Den første er den traditionelle metode14,15,16 af nedværdigende polysaccharid ved hjælp af en høj koncentration af syre og derefter tilføje en kolorimetrisk indikator til at slukke koncentrationen i prøven. Den anden metode, der er udviklet i vores laboratorium, anvender Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ved hjælp af et antialginat monoklonalt antistof (mAb) udviklet af QED Biosciences. ELISA-metoden viser sig at være mere specifik og følsom end den uronsyreanalyse og giver mulighed for sikrere brug på grund af undgåelse af den stærkt koncentrerede svovlsyre. Med ELISA’s evne til at blive brugt direkte på patientspytprøver til at måle alginat kan det udvikles som et overvågningsdiagnostisk værktøj til at følge mængden af alginat, der findes i lungerne i forskellige perioder af infektionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både SCV og alginat er vigtige sygdommarkører involveret i flere kroniske infektioner. Derfor er evnen til at dyrke SCV samt studere regulering og produktion af alginat af P. aeruginosa er en integreret del af opdagelsen af nye behandlinger for disse kroniske sygdomme.
SCV stammer er notorisk vanskelige at vokse på grund af deres langsomme vækstrate4 i forhold til andre P. aeruginosa stammer, som hjælper i deres antimikrobielle resistens<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
