Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato
Summary
Qui, descriviamo una condizione di crescita alla cultura la piccola variante colonia di Pseudomonas aeruginosa. Descriviamo anche due metodi distinti per il rilevamento e la quantificazione dell’algerino exopolysaccharide prodotto da P. aeruginosa utilizzando un tradizionale saggio di carbazole di acido uronico e un anticorpo monoclonale specifico algerino (mAb) a base di ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico, può sovraprodurre un algiato esopolisaccare risultante in un fenotipo unico chiamato mucoidy. L’alginato è collegato a infezioni polmonari croniche con conseguente prognosi infagnata in pazienti con fibrosi cistica (CF). Comprendere i percorsi che regolano la produzione di alginato può aiutare nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla formazione altata. Un altro fenotipo correlato alla malattia è la variante della piccola colonia (SCV). SCV è dovuto alla lenta crescita di batteri e spesso associato ad una maggiore resistenza agli antimicrobici. In questo articolo, mostriamo per la prima volta un metodo per coltivare una forma geneticamente definita di P. aeruginosa SCV a causa di mutazioni della biosintesi pirimofina. Il completamento di basi azotate, uracil o citosina, restituisce la normale crescita a questi mutanti, dimostrando la presenza di un percorso di recupero che sbircia basi libere dall’ambiente. Successivamente, discutiamo due metodi per la misurazione dell’alginato batterico. Il primo metodo si basa sull’idrolisi del polisaccharide al suo monomero acido uronico seguito dalla derivazione con un reagente cromogenico, il carbazole, mentre il secondo metodo utilizza un ELISA basato su un mAb commercialmente disponibile, specifico per algerino. Entrambi i metodi richiedono una curva standard per la quantificazione. Dimostriamo anche che il metodo immunologico è specifico per la quantificazione alginata e può essere utilizzato per la misurazione dell’alginato nei campioni clinici.
Introduction
Le infezioni polmonari croniche con Pseudomonas aeruginosa sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con fibrosi cistica (CF). Durante la prima infanzia, i pazienti sono colonizzati da più patogeni batterici tra cui isolati non mucoidi di P. aeruginosa1,2. L’emergere della variante della piccola colonia (SCV) isola così come gli isolati mucoidi è un marcatore per l’insorgenza delle infezioni croniche. Gli isolati di SCV sono altamente resistenti ai farmaci3 a causa dei loro lenti tassi di crescita4, il che li rende un grave deterrente nei reggimenti di trattamento e altre infezioni croniche5 da P. aeruginosa. Il lavoro di Al Ahmar et al.6 ha mostrato un legame tra SCV e mucoidy collegato dalla biosintesi della pirimofina de novo. La fame di pirimidine, a causa di mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di pirimidine, ha portato al fenotipo SCV nel ceppo di riferimento non mucoide PAO1 e alla derivata mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
Anche se la sovrapproduzione algerata è un importante marcatore di malattia per le infezioni polmonari croniche nella CF, non è chiaro se esista una correlazione diretta tra la quantità di patologia alginata e polmonare, e non è chiaro se l’alginato possa essere utilizzato come marcatore di prognosi per il trattamento7. La produzione di alginati è regolata principalmente da due operoni, un operone normativo (algUmucABCD)8,9 e l’operone biosintetico ( operonealgD) 10,11. La produzione di algerino è strettamente regolata dal fattore sigma AlgU9,12 (noto anche come AlgT) e dalla degradazione del fattore anti-sigma MucA13. La capacità di monitorare la produzione di algerino in situ dai campioni di espettorato dei pazienti può aiutare nello sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.
Qui, descriviamo una condizione di crescita che rileva la presenza di SCV causata da mutanti che non possono sintetizzare la pirimidine de novo. Il completamento dell’uracile e/o della citosina, la base azotata del nucleotide pirimidine, a medio attiva il percorso di recupero, ripristinando così la normale crescita nei mutanti. Questo metodo di crescita per questi specifici mutanti SCV può essere utilizzato come metodo di screening per identificare le mutazioni della pirimofina nei campioni di pazienti. Inoltre, discutiamo due metodi per il rilevamento e la misurazione di alginato prodotto e secreto da P. aeruginosa. Il primo è il metodo tradizionale14,15,16 di degradare il polisaccaluro utilizzando un’alta concentrazione di acido e quindi l’aggiunta di un indicatore colorimetrico per quantificare la concentrazione nel campione. Il secondo metodo, sviluppato nel nostro laboratorio, utilizza l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-alginato (mAb) sviluppato da QED Biosciences. Il metodo ELISA si dimostra più specifico e sensibile rispetto all’acido uronico e consente un uso più sicuro a causa dell’evitamento dell’acido solforico altamente concentrato. Con la capacità dell’ELISA di essere utilizzato direttamente su campioni di espettorato del paziente per misurare l’alginato, può essere sviluppato come strumento diagnostico di monitoraggio per seguire la quantità di alginato presente nei polmoni in diversi periodi dell’infezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sia SCV che algerato sono importanti marcatori di malattia implicati in diverse infezioni croniche. Pertanto, la capacità di far crescere sCV e di studiare la regolazione e la produzione di alginato da P. aeruginosa è parte integrante della scoperta di nuovi trattamenti per queste malattie croniche.
I ceppi DiCV sono notoriamente difficili da coltivare a causa del loro tasso di crescita lento4 rispetto ad altri ceppi P. aeruginosa, che aiuta nella lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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