Qui, descriviamo una condizione di crescita alla cultura la piccola variante colonia di Pseudomonas aeruginosa. Descriviamo anche due metodi distinti per il rilevamento e la quantificazione dell'algerino exopolysaccharide prodotto da P. aeruginosa utilizzando un tradizionale saggio di carbazole di acido uronico e un anticorpo monoclonale specifico algerino (mAb) a base di ELISA.
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Articolo metodologico
Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico, può sovraprodurre un algiato esopolisaccare risultante in un fenotipo unico chiamato mucoidy. L'alginato è collegato a infezioni polmonari croniche con conseguente prognosi infagnata in pazienti con fibrosi cistica (CF). Comprendere i percorsi che regolano la produzione di alginato può aiutare nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla formazione altata. Un altro fenotipo correlato alla malattia è la variante della piccola colonia (SCV). SCV è dovuto alla lenta crescita di batteri e spesso associato ad una maggiore resistenza agli antimicrobici. In questo articolo, mostriamo per la prima volta un metodo per coltivare una forma geneticamente definita di P. aeruginosa SCV a causa di mutazioni della biosintesi pirimofina. Il completamento di basi azotate, uracil o citosina, restituisce la normale crescita a questi mutanti, dimostrando la presenza di un percorso di recupero che sbircia basi libere dall'ambiente. Successivamente, discutiamo due metodi per la misurazione dell'alginato batterico. Il primo metodo si basa sull'idrolisi del polisaccharide al suo monomero acido uronico seguito dalla derivazione con un reagente cromogenico, il carbazole, mentre il secondo metodo utilizza un ELISA basato su un mAb commercialmente disponibile, specifico per algerino. Entrambi i metodi richiedono una curva standard per la quantificazione. Dimostriamo anche che il metodo immunologico è specifico per la quantificazione alginata e può essere utilizzato per la misurazione dell'alginato nei campioni clinici.
Introduzione
Le infezioni polmonari croniche con Pseudomonas aeruginosa sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con fibrosi cistica (CF). Durante la prima infanzia, i pazienti sono colonizzati da più patogeni batterici tra cui isolati non mucoidi di P. aeruginosa1,2. L'emergere della variante della piccola colonia (SCV) isola così come gli isolati mucoidi è un marcatore per l'insorgenza delle infezioni croniche. Gli isolati di SCV sono altamente resistenti ai farmaci3 a causa dei loro lenti tassi di crescita4, il che li rende un....
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Protocollo
1. Condizioni di crescita SCV e attivazione fisiologica del percorso di salvataggio
- Rilevamento di SCV.
- Streak il P. aeruginosa ceppi PAO1, PAO1pyrD, PAO581, e PAO581pira su preriscaldato Pseudomonas agar (PIA) e crescere a 37 gradi centigradi per 48 h. Sulla piastra di crescita identificare un singolo isolato colonia che ha il fenotipo SCV (dimensione della colonia di 1,3 mm in contrapposizione alla dimensione normale della colonia 3-5 mm).
- Ripetere il passaggio 1.1.1 per ottenere un isolamento puro dell'SCV.
NOTA: La crescita può richiedere fino a 72 h a causa del lento tasso di crescita delle colon....
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Risultati
La figura 1 mostra piastre di PAO1 e PAO581 con o senza delezione in-frame nel gene pyrD (un gene nel percorso di biosintesi pirimidina) che si traduce in SCV6. Il mutante PAO1 SCV è stato riportato alla normale crescita in risposta al completamento dell'uracile (Figura 1A,B). Inoltre, il mutanteSCVPAO581 è stato restituito alla mucoidy con lo stesso trattamento dell'urac.......
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Discussione
Sia SCV che algerato sono importanti marcatori di malattia implicati in diverse infezioni croniche. Pertanto, la capacità di far crescere sCV e di studiare la regolazione e la produzione di alginato da P. aeruginosa è parte integrante della scoperta di nuovi trattamenti per queste malattie croniche.
I ceppi DiCV sono notoriamente difficili da coltivare a causa del loro tasso di crescita lento4 rispetto ad altri ceppi P. aeruginosa, che aiuta nella loro.......
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Dichiarazioni
L'autore Hongwei D. Yu è Chief Science Officer e co-fondatore di Progenesis Technologies, LLC.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | tramite Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | tramite Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Acido Borico Prodotti | di Ricerca International Corp. | 10043-35-3 | |
| Incubatore ad armadio | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Tampone carbonato-bicarbonato | Sigma | C3041 | |
| Provette da centrifuga (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | tramite Fisher Scientific |
| Provette per colture | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Cuvetta scientifica |
| Polistirene (1,5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | tramite Fisher |
| Scientific Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Anelli di inoculazione monouso | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Acido D-mannuronico Sodio | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginato | FMC | 2133 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP906-5 | per biologia molecolare |
| Anticorpo monoclonale anti-alginato di topo | QED Biosciences | N/A | Lotto # :15725/15726 |
| Polvere salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Topo Anticorpo Poly-HRP | Thermo Scientific | 32230 | tramite Fisher Scientific |
| Idrossido di potassio | Fisher Scientific | 1310-58-3 | tramite Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Brodo di isolamento (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Stuzzicadenti rotondi | Alginato | Any brand | |
| (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Latte scremato | Difco | 232100 | tramite spettrofotometro SmartSpec Plus di Fisher Scientific |
| BioRad | 170-2525 | o fornitore preferito | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | multimodale Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | i3x | o fornitore preferito |
| Piastra di Petri sterile 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | tramite Fisher Scientific |
| Acido solforico | Fisher Scientific | A298-212 | di grado tecnico |
| (2 soluzioni normali) | R& D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
Riferimenti
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J.
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Ristampe e permessi
