Cultuur van kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosa en Quantitatie van zijn Alginate
Summary
Hier beschrijven we een groeivoorwaarde om de kleine kolonievariant van Pseudomonas aeruginosate kweken. We beschrijven ook twee afzonderlijke methoden voor de detectie en kwantificering van de exopolysaccharide alginaat geproduceerd door P. aeruginosa met behulp van een traditionele uronic zuur carbazole test en een alginaat-specifieke monoklonale antilichaam (mAb) gebaseerde ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische Gram-negatieve bacteriële ziekteverwekker, kan overproduceren een exopolysaccharide alginaat resulteert in een unieke fenotype genaamd slijmvlies. Alginaat is gekoppeld aan chronische longinfecties wat resulteert in een slechte prognose bij patiënten met cystische fibrose (CF). Inzicht in de paden die de productie van alginaat reguleren, kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die gericht zijn op de alginaatvorming. Een ander ziektegerelateerd fenotype is de kleine kolonievariant (SCV). SCV is te wijten aan de trage groei van bacteriën en vaak geassocieerd met verhoogde resistentie tegen antimicrobiële stoffen. In dit artikel tonen we eerst een methode om een genetisch gedefinieerde vorm van P. aeruginosa SCV te kweken als gevolg van pyrimidine biosynthesemutaties. Suppletie van stikstofhoudende bases, uracil of cytosine, geeft de normale groei terug aan deze mutanten, het aantonen van de aanwezigheid van een bergingstraject dat vrije bases uit het milieu scharrelt. Vervolgens bespreken we twee methoden voor het meten van bacteriële alginaat. De eerste methode is gebaseerd op de hydrolyse van de polysaccharide tot zijn uronic acid monomeer, gevolgd door derivatisatie met een chromogene reagens, carbazole, terwijl de tweede methode een ELISA gebruikt op basis van een commercieel verkrijgbare, alginaat-specifieke mAb. Beide methoden vereisen een standaardcurve voor kwantificering. We tonen ook aan dat de immunologische methode specifiek is voor alginaatkifie en kan worden gebruikt voor de meting van alginaat in de klinische monsters.
Introduction
Chronische longinfecties met Pseudomonas aeruginosa zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met cystische fibrose (CF). Tijdens de vroege kindertijd worden patiënten gekoloniseerd door meerdere bacteriële pathogenen, waaronder niet-mucoïde isolaten van P. aeruginosa1,2. De totstandkoming van de kleine kolonievariant (SCV) isoleert evenals slijmervormige isolaten is een teller voor het begin aan chronische besmettingen. SCV isolaten zijn zeer resistente3 als gevolg van hun trage groeipercentages4, waardoor ze een ernstig afschrikmiddel in de behandeling regimenten en andere chronische infecties5 door P. aeruginosa. Werk van Al Ahmar et al.6 toonde een verband tussen SCV en slijmvlies verbonden door de novo pyrimidine biosynthese. Pyrimidinehonger, als gevolg van mutaties in genen die betrokken zijn bij de productie van pyrimidine, resulteerde in SCV fenotype in de nonmucoid referentiestam PAO1 en het slijmvliesderivaat PAO581 (PAO1mucA25).
Hoewel alginaatoverproductie een belangrijke ziektemarker is voor chronische longinfecties in CF, is het niet duidelijk of er een directe correlatie is tussen de hoeveelheid alginaat en longpathologie, en het is onduidelijk of alginaat kan worden gebruikt als prognosemarker voor behandeling7. De productie van alginaat wordt voornamelijk gereguleerd door twee operonen, een regelgevende operon (algUmucABCD)8,9 en de biosynthetische operon (algD operon)10,11. Alginaat productie wordt strak gereguleerd door de sigma factor AlgU9,12 (ook bekend als AlgT) en de afbraak van de anti-sigma factor MucA13. De mogelijkheid om de productie van alginaat ter plaatse te controleren van de sputummonsters van de patiënten kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties.
Hier beschrijven we een groeitoestand die de aanwezigheid van SCV detecteert die wordt veroorzaakt door mutanten die de pyrimidine de novo niet kunnen synthetiseren. Suppletie van uracil en/of cytosine, de stikstofachtige basis van pyrimidine nucleotide, aan het medium activeert het bergingstraject, waardoor de normale groei in mutanten wordt hersteld. Deze groeimethode voor deze specifieke SCV mutanten kan worden gebruikt als een screeningmethode om pyrimidinemutaties in patiëntenmonsters te identificeren. Daarnaast bespreken we twee methoden voor detectie en meting van alginaat geproduceerd en afgescheiden door P. aeruginosa. De eerste is de traditionele methode14,15,16 van het vernederen van de polysaccharide met behulp van een hoge concentratie zuur en vervolgens het toevoegen van een colorimetrische indicator om de concentratie in het monster te kwantificeren. De tweede methode, ontwikkeld in ons laboratorium, maakt gebruik van de Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) met behulp van een anti-alginaat monoklonale antilichaam (mAb) ontwikkeld door QED Biosciences. De ELISA-methode blijkt specifieker en gevoeliger te zijn dan de uronic zuurtest en maakt veiliger gebruik mogelijk door het vermijden van het sterk geconcentreerde zwavelzuur. Met het vermogen van de ELISA om direct op de sputummonsters van de patiënt te worden gebruikt om alginaat te meten, kan het worden ontwikkeld als een diagnostisch hulpmiddel voor monitoring om de hoeveelheid alginaat in de longen te volgen in verschillende perioden van de infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zowel SCV en alginaat zijn belangrijke ziekte markers betrokken bij verschillende chronische infecties. Daarom is het vermogen om SCV te laten groeien en de regulatie en productie van alginaat door P. aeruginosa te bestuderen een integraal onderdeel van de ontdekking van nieuwe behandelingen voor deze chronische ziekten.
SCV stammen zijn notoir moeilijk om te groeien als gevolg van hun trage groeipercentage 4 in vergelijking met andere P. aeruginosa st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R44GM1113545 en P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
