Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato
Summary
Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.
Introduction
Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecimiento4, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas5 por P. aeruginosa. 6mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento7. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)8,9 y el operon biosintético (algD operon)10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.
Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.
Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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