Kultur av liten koloni variant av Pseudomonas aeruginosa og kvantasjon av sin Alginate
Summary
Her beskriver vi en veksttilstand for å kultur den lille kolonivarianten av Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder for deteksjon og kvantitasjon av exopolysakkaridalgatet produsert av P. aeruginosa ved hjelp av en tradisjonell uronisk syrekarbazolanalyse og et algonalt spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) basert ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen, kan overprodusere et exopolysakkaridalgin som resulterer i en unik fenotype kalt mucoidy. Alginat er knyttet til kroniske lungeinfeksjoner som resulterer i dårlig prognose hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Forstå banene som regulerer produksjonen av algetrekkan hjelpe i utviklingen av nye terapeutiske strategier rettet mot den algeiske formasjonen. En annen sykdomsrelatert fenotype er den lille kolonivarianten (SCV). SCV skyldes den langsomme veksten av bakterier og ofte forbundet med økt motstand mot antimikrobielle midler. I dette papiret viser vi først en metode for å kulturing en genetisk definert form av P. aeruginosa SCV på grunn av pyridin biosyntese mutasjoner. Tilskudd av nitrogenholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale veksten til disse mutantene, og viser tilstedeværelsen av en redningsvei som scavenges frie baser fra miljøet. Deretter diskuterer vi to metoder for måling av bakteriell alginat. Den første metoden er avhengig av hydrolysen av polysakkarid til sin uronic acid monomer etterfulgt av avledningmed en kromogen reagens, karbazole, mens den andre metoden bruker en ELISA basert på en kommersielt tilgjengelig, algon-spesifikk mAb. Begge metodene krever en standard kurve for kvantasjon. Vi viser også at den immunologiske metoden er spesifikk for alginatkvantifisering og kan brukes til måling av alginat i de kliniske prøvene.
Introduction
Kroniske lungeinfeksjoner med Pseudomonas aeruginosa er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos pasienter med cystisk fibrose (CF). I tidlig barndom koloniseres pasienter av flere bakterielle patogener, inkludert ikke-mucoid isolater av P. aeruginosa1,2. Fremveksten av den lille kolonivarianten (SCV) isolerer samt mucoid isolater er en markør for utbruddet til kroniske infeksjoner. SCV isolater er svært resistente3 på grunn av deres langsomme vekstrater4, noe som gjør dem en alvorlig avskrekkende i behandling regimenter og andre kroniske infeksjoner5 av P. aeruginosa. Arbeid av Al Ahmar et al.6 viste en sammenheng mellom SCV og mucoidy knyttet sammen av de novo pyrimidine biosyntese. Pyrimidinsult, på grunn av mutasjoner i gener involvert med pyrimidinproduksjon, resulterte i SCV fenotype i nonmucoid referansestammen PAO1 og mucoidderivatet PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduksjon er en viktig sykdomsmarkør for kroniske lungeinfeksjoner i CF, er det ikke klart om det er en direkte sammenheng mellom mengden alginat og lungepatologi, og det er uklart om alginat kan brukes som prognosemarkør for behandling7. Alginatproduksjonen er hovedsakelig regulert av to operoner, en regulatorisk operon (algUmucABCD)8,9 og biosyntetisk operon (algD operon)10,11. Algiat produksjonen er tett regulert av sigma faktor AlgU9,12 (også kjent som AlgT) og nedbrytning av anti-sigma faktor MucA13. Evnen til å overvåke produksjonen av alginatin in situ fra pasientenes sputumprøver kan hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske alternativer.
Her beskriver vi en veksttilstand som oppdager tilstedeværelsen av SCV forårsaket av mutanter som ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskudd av uracil og/eller cytosin, nitrogenholdig base av pyrimidinnukleotid, til mediet aktiverer bergingsveien, og gjenoppretter dermed den normale veksten i mutanter. Denne vekstmetoden for disse spesifikke SCV-mutantene kan brukes som en screeningmetode for å identifisere pyrimidinmutasjoner i pasientprøver. I tillegg diskuterer vi to metoder for deteksjon og måling av alginat produsert og utskilt av P. aeruginosa. Den første er den tradisjonelle metoden14,15,16 for å forringe polysakkarid ved hjelp av en høy konsentrasjon av syre og deretter legge til en kolormetrisk indikator for å kvantate konsentrasjonen i prøven. Den andre metoden, utviklet i vårt laboratorium, benytter enzymet-linked immunosorbent analyse (ELISA) ved hjelp av en anti-algonat monoklonalt antistoff (mAb) utviklet av QED Biosciences. ELISA-metoden viser seg å være mer spesifikk og følsom enn uronisk syreanalyse og gir sikrere bruk på grunn av unngåelse av den svært konsentrerte svovelsyre. Med elisas evne til å brukes direkte på pasientprøver for å måle alginat, kan det utvikles som et overvåkingsdiagnostisk verktøy for å følge mengden alginat tilstede i lungene i forskjellige perioder av infeksjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både SCV og alginat er viktige sykdomsmarkører involvert i flere kroniske infeksjoner. Derfor er evnen til å vokse SCV samt studere regulering og produksjon av alginat av P. aeruginosa integrert i oppdagelsen av nye behandlinger for disse kroniske sykdommene.
SCV stammer er notorisk vanskelig å vokse på grunn av deres langsomme vekstrate4 sammenlignet med andre P. aeruginosa stammer, som hjelpemidler i deres antimikrobielle motstand<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gir R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
