Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval
Summary
Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.
Abstract
Au fur et à mesure que notre compréhension de la neurobiologie a progressé, des analyses moléculaires sont souvent effectuées sur de petites zones cérébrales telles que le cortex préfrontal médial (MPFC) ou le noyau accumbens. Le défi dans ce travail est de disséquer la zone correcte tout en préservant le microenvironnement à examiner. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse utilisant des ressources facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode préserve l’acide nucléique et les protéines en gardant le tissu congelé tout au long du processus. Les cerveaux sont coupés en sections de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une matrice cérébrale et disposés sur une plaque de verre congelée. Les repères de chaque section sont comparés à une référence, comme l’Atlas du cerveau Allen Mouse, et les régions sont disséquées à l’aide d’un scalpel froid ou d’un poinçon de biopsie. Le tissu est ensuite stocké à -80 oC jusqu’à l’utilisation. Grâce à ce processus rat et souris mPFC, noyau accumbens, hippocampe dorsale et ventral et d’autres régions ont été analysés avec succès à l’aide de qRT-PCR et d’essais occidentaux. Cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs.
Introduction
Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas1, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.
La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés2,,3,4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats., Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq5, le MAPSeq6 et le HPLC7 sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau2,,4,5,6.
Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales10. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.
La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.
Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen1 ou d’autres atlas cérébraux16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces travaux décrivent une technique pour isoler de petites régions spécifiques du cerveau tout en limitant la dégradation de l’acide nucléique et des protéines. Les dommages aux tissus cérébraux se produisent rapidement une fois qu’un organisme meurt. Ceci est dû en partie à une accumulation rapide de glutamate extracellulaire et l’excitotoxicité résultante qui se produit21. L’ARN Messenger est particulièrement vulnérable à la dégradation22,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH, DA043982 et DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
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