Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu
Summary
Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.
Abstract
Nörobiyoloji anlayışımız ilerledikçe, moleküler analizler genellikle medial prefrontal korteks (mPFC) veya nükleus accumbens gibi küçük beyin bölgelerinde yapılır. Bu çalışmada sorun incelenecek mikroortamı korurken doğru alanı incelemektir. Bu yazıda, çoğu laboratuvarda kolayca bulunan kaynakları kullanarak basit, düşük maliyetli bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, işlem boyunca doku dondurulmuş tutarak nükleik asit ve proteinleri korur. Beyinler bir beyin matrisi kullanılarak 0.5-1.0 mm kesitler halinde kesilir ve donmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Her bölümdeki yerler Allen Mouse Beyin Atlası gibi bir referansla karşılaştırılır ve bölgeler soğuk neşter veya biyopsi yumruğu kullanılarak kesilir. Doku daha sonra kullanıma kadar -80 °C’de saklanır. Bu işlem sayesinde sıçan ve fare mPFC, nucleus accumbens, dorsal ve ventral hipokampus ve diğer bölgelerde başarıyla qRT-PCR ve Batı tahlilleri kullanılarak analiz edilmiştir. Bu yöntem açık yerler tarafından tespit edilebilir beyin bölgeleri ile sınırlıdır.
Introduction
Bu çalışma, bir rehber olarak Allen Mouse Beyin Atlası1gibi bir referans kullanarak yüksek kaliteli nükleik asit veya protein çıkarılması için dondurulmuş beyin bölgelerinin diseksiyon göstermektedir. Bu teknikte beyinler flaş dondurulmuş ve dondurulmuş bir durumda muhafaza edilirken daha sonra kesit ve diseksiyon için -80 °C’de saklanır. Bu süreç araştırmacı bir oturumda beyin çok sayıda hasat ve daha sonra birden fazla beyin bölgeleri doğru bir koleksiyon için onları incelemek için izin verir.
Gen ve protein ekspresyonu ile ilgili soruları yanıtlarken genellikle beyin bölgelerinin (ROI) doğru toplanması gereklidir. Farmakoloji, elektrofizyoloji ve optogenetik yabani tip veya genetiği değiştirilmiş kemirgenler üzerinde gözlenen davranışları destekleyen moleküler değişikliklerin aydınlatılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir iken2,3,4, transkripsiyon ve proteomlarda indüklenen değişikliklerin ölçümü genellikle bu bulguları desteklemek için kullanılır. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), batı lekeleme, RNAseq5,MAPSeq6 ve HPLC7 gibi teknikler sağlam ve nispeten düşük maliyet, birçok laboratuvarküçük beyin bölgeleri içinde indüklenen moleküler değişiklikleri incelemek için izin2,4,5,6.
Beyin bölgelerinden nükleik asit veya protein ayıklamak ve arındırmak için çeşitli yollar vardır8,9,10,11,12. Birçok laboratuvarlar hasat sırasında buz üzerinde beyinleri dondurup keserek beyin bölgelerini hasat eder9,13. Bu yaklaşım yüksek kaliteli nükleik asit ve proteine yol açsa da, bu sıcaklıklarda dokunun mikro ortamında bozulma olabileceğinden biraz zaman sınırlıdır. Bu özellikle bir oturuşta çok sayıda hayvanı veya ROI’yi incelemeye çalışırken doğru olabilir. Numuneleri dondurulmuş tutmak, araştırmacıya nispeten saf numuneler toplama çabasında her bölümün her iki tarafındaki simgeleri dikkatle karşılaştırması için zaman sağlarken, labile hedef moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Lazer yakalama beyin bölgelerinden RNA veya protein analizi için doku toplamak için başka bir yoldur10. Bu işlem, çok küçük ve düzensiz şekilli ROI’ların tespit edilip izole edilebildiği mekanik diseksiyondan daha üstündür. Ancak, lazer yakalama pahalı ekipman ve reaktiflerin kullanımı ile sınırlıdır, zaman alıcı ve aynı zamanda örnek bozulmasına daha duyarlı olabilir.
Dondurulmuş dokularda mikropunch diseksiyonu yeni değildir. Miklos Palkovits ve diğerleri tarafından erken kağıtları ayrıntılı olarak temel teknikleri açıklamak14,15. Bu sunum büyük ölçüde verimliliği kolaylaştırmak ve gerekli ekipman giderini azaltmak için bazı iyileştirmeler ile, orijinal çalışma izler. Örneğin, beyin bölümleri dondurulmuş beyin bloğu yerine bir kriyostat yapılır. Bu, yatırım getirisi örnekleri toplamak için gereken kesit sayısını azaltan daha kalın bölümler üretir. Bu yöntem aynı zamanda yalıtılmış bir kutu içinde kuru buz üzerinde oturur dondurulmuş cam plaka üzerinde örnekleri inceler. Bu, üzerinde çalışmak için tezgah bir alt donma aşaması üretir. Bu şekilde incelenen bölümler kolayca manipüle edilebilir, böylece araştırmacı her bölümün her iki tarafını da istenilen Yatırım Getirisi dışındaki bölgelerden gelen kontaminasyonu sınırlamak için bir referansla karşılaştırmak için.
Bu protokolün avantajları 1) beyin protein ve nükleik asit korunmasına yardımcı olur ve dikkatle ROI hasat için araştırmacı zaman verir ve 2) gerekli reaktifler ucuz ve en moleküler biyoloji laboratuarlarında bulunan süreç boyunca dondurulmuş bir durumda tutulur. Bu süreçte, tüm beyinler bir beyin matris0.5-1.0 mm kesitli ve sürekli kuru buz ile soğutulmuş bir dondurulmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Allen BeyinAtlası bulunan Yerler 1 veya diğer beyin atlasları16,17 ilgi bölgelerini tanımlamak için kullanılır, hangi sonra soğuk bir yumruk veya neşter kullanılarak kesilir. Doku asla çözülmemedığından, bu şekilde hasat edilen bölgeler, downstream analizleri için yüksek kaliteli RNA ve protein sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, nükleik asit ve protein ingradasyonunu sınırlandırırken beynin küçük, belirli bölgelerini izole etme tekniğini tanımlar. Bir organizma öldüğünde beyin dokularına zarar hemen gerçekleşir. Bu kısmen ekstrasellüler glutamat hızlı birikme ve21oluşur sonucu eksitotoksisite kaynaklanmaktadır. Messenger RNA özellikle bozulmaya karşı savunmasızdır 22,23. Protein ve nükleik asit dökümü büyük ölçü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH, DA043982 ve DA046196 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
