Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen
Summary
Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.
Abstract
Im Verlauf unseres Verständnisses der Neurobiologie werden molekulare Analysen häufig an kleinen Hirnbereichen wie dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) oder Nucleus accumbens durchgeführt. Die Herausforderung bei dieser Arbeit besteht darin, den richtigen Bereich zu sezieren und gleichzeitig die zu untersuchende Mikroumgebung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache, kostengünstige Methode, bei der Ressourcen verwendet werden, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind. Diese Methode bewahrt Nukleinsäure und Proteine, indem das Gewebe während des gesamten Prozesses eingefroren bleibt. Gehirne werden mit einer Hirnmatrix in 0,5-1,0 mm-Abschnitte geschnitten und auf einer gefrorenen Glasplatte angeordnet. Landmarken innerhalb jedes Abschnitts werden mit einer Referenz verglichen, z. B. der Allen Mouse Brain Atlas, und Regionen werden mit einem kalten Skalpell oder Biopsie-Punch seziert. Gewebe wird dann bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert. Durch diesen Prozess wurden Ratten- und Maus-mPFC, Nucleus accumbens, dorsaler und ventraler Hippocampus und andere Regionen erfolgreich mit qRT-PCR und Western Assays analysiert. Diese Methode ist auf Hirnregionen beschränkt, die durch klare Landmarken identifiziert werden können.
Introduction
Diese Arbeit veranschaulicht die Zerlegung von gefrorenen Hirnregionen zur Extraktion von hochwertiger Nukleinsäure oder Protein unter Verwendung eines Verweises, wie z. B. des Allen Mouse Brain Atlas1, als Leitfaden. Bei dieser Technik werden Gehirne blitzgefroren und bei -80 °C für spätere Schnitte und Sezieren gelagert, während sie in einem gefrorenen Zustand gehalten werden. Dieser Prozess ermöglicht es dem Forscher, eine große Anzahl von Gehirnen in einer Sitzung zu ernten und sie später für eine genaue Sammlung mehrerer Hirnregionen zu sezieren.
Die genaue Erfassung von Hirnregionen von Interesse (ROIs) ist oft erforderlich, wenn Fragen im Zusammenhang mit Gen- und Proteinexpression beantwortet werden. Während Pharmakologie, Elektrophysiologie und Optogenetik an Wildtypen oder genetisch veränderten Nagetieren verwendet werden können, um molekulare Veränderungen aufzuklären, die den beobachteten Verhaltensweisen2,3,4zugrunde liegen, wird die Messung induzierter Veränderungen in Transkriptomen und Proteomen häufig verwendet, um diese Befunde zu unterstützen. Techniken wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), Western Blotting, RNAseq5, MAPSeq6 und HPLC7 sind robust und relativ kostengünstig, so dass viele Labore induzierte molekulare Veränderungen innerhalb kleinerHirnregionen2,4,5,6untersuchen können.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, Nukleinsäure oder Protein aus Hirnregionen8,9,10,11,12zu extrahieren und zu reinigen. Viele Labore ernten Hirnregionen, indem sie gehirnzum Zeitpunkt der Ernte9,,13auf Eis kühlen und schneiden. Während dieser Ansatz zu hochwertiger Nukleinsäure und Protein führen kann, ist er etwas zeitlich begrenzt, da bei diesen Temperaturen ein Abbau innerhalb der Mikroumgebung des Gewebes stattfinden kann. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn versucht wird, eine große Anzahl von Tieren oder ROIs in einer Sitzung zu sezieren. Das Einfrieren von Proben hilft dabei, labile Zielmoleküle zu erhalten und bietet dem Forscher Zeit, um Die Sehenswürdigkeiten auf beiden Seiten jedes Abschnitts sorgfältig zu vergleichen, um relativ reine Proben zu sammeln. Laser-Capture ist eine weitere Möglichkeit, Gewebe für RNA- oder Proteinanalyse aus Hirnbereichen zu sammeln10. Dieses Verfahren ist der mechanischen Zerlegung überlegen, da sehr kleine und unregelmäßig geformte ROIs identifiziert und isoliert werden können. Die Lasererfassung wird jedoch durch den Einsatz teurer Geräte und Reagenzien eingeschränkt, ist zeitaufwändig und kann auch anfälliger für Probendegradation sein.
Micropunch-Sektion auf gefrorenen Geweben ist nicht neu. Frühe Arbeiten von Miklos Palkovits und anderen beschreiben die Grundtechniken im Detail14,15. Diese Präsentation folgt weitgehend der ursprünglichen Arbeit, mit einigen Verbesserungen, um die Effizienz zu erleichtern und die Kosten für die benötigte Ausrüstung zu verringern. Zum Beispiel werden Gehirnabschnitte in einem gefrorenen Hirnblock und nicht auf einem Kryostat hergestellt. Dadurch entstehen dickere Abschnitte, wodurch die Anzahl der Abschnitte reduziert wird, die zum Sammeln von ROI-Proben benötigt werden. Diese Methode seziert auch Proben auf einer gefrorenen Glasplatte, die auf Trockeneis in einer isolierten Box sitzt. Dadurch entsteht eine Untergefrierstufe an der Bank, auf der gearbeitet werden kann. Abschnitte, die auf diese Weise seziert werden, sind leicht manipulierbar, so dass der Forscher beide Seiten jedes Abschnitts mit einer Referenz vergleichen kann, um die Kontamination aus Regionen außerhalb des gewünschten ROI zu begrenzen.
Vorteile dieses Protokolls sind, dass 1) das Gehirn während des gesamten Prozesses in einem gefrorenen Zustand gehalten wird, was hilft, Protein und Nukleinsäure zu erhalten und dem Forscher Zeit gibt, ROIs sorgfältig zu ernten, und 2) die erforderlichen Reagenzien sind kostengünstig und finden sich in den meisten molekularbiologischen Labors. Dabei werden ganze Gehirne in einer Hirnmatrix auf 0,5–1,0 mm geschnitten und auf eine gefrorene Glasplatte gelegt, die kontinuierlich mit Trockeneis gekühlt wird. Landmarken, die im Allen Brain Atlas1 oder anderen Hirnatlanten16,17 gefunden werden, werden verwendet, um Interessengebiete zu identifizieren, die dann entweder mit einem kalten Schlag oder Skalpell seziert werden. Da das Gewebe nie aufgetaut wird, bieten auf diese Weise geerntete Regionen hochwertige RNA und Proteine für nachgelagerte Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine Technik, um kleine, spezifische Regionen des Gehirns zu isolieren und gleichzeitig den Abbau von Nukleinsäure und Protein zu begrenzen. Schäden am Hirngewebe passieren schnell, sobald ein Organismus stirbt. Dies ist teilweise auf eine schnelle Anhäufung von extrazellulärem Glutamat und die daraus resultierende Exzitotoxizität zurückzuführen, die21auftritt. Messenger RNA ist besonders anfällig für Degradation22,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NIH, DA043982 und DA046196 unterstützt.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
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