Insamling av frysta gnagare hjärnregioner för nedströms analyser

Summary

Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg.

Abstract

Som vår förståelse av neurobiologi har utvecklats, molekylära analyser utförs ofta på små hjärnan områden såsom den mediala prefrontala cortex (mPFC) eller kärnan accumbens. Utmaningen i detta arbete är att dissekera rätt område samtidigt som den mikromiljö som ska undersökas bevaras. I det här dokumentet beskriver vi en enkel, billig metod med resurser som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. Denna metod bevarar nukleinsyra och proteiner genom att hålla vävnaden fryst under hela processen. Hjärnor skärs i 0,5–1,0 mm sektioner med hjälp av en hjärnmatris och är ordnade på en frusen glasplatta. Landmärken inom varje avsnitt jämförs med en referens, till exempel Allen Mouse Brain Atlas, och regioner dissekeras med en kall skalpell eller biopsi punch. Vävnad lagras sedan vid -80 °C tills den används. Genom denna process råtta och mus mPFC, nucleus accumbens, dorsala och ventrala hippocampus och andra regioner har framgångsrikt analyserats med qRT-PCR och västerländska analyser. Denna metod är begränsad till hjärnan regioner som kan identifieras av tydliga landmärken.

Introduction

Detta arbete illustrerar dissekering av frysta hjärnregioner för utvinning av högkvalitativ nukleinsyra eller protein med hjälp av en referens, såsom Allen Mouse Brain Atlas¹, som en guide. I denna teknik är hjärnor flashfrysta och lagras vid -80 °C för senare snittning och dissekering samtidigt som de hålls i fruset tillstånd. Denna process gör det möjligt för forskaren att skörda ett stort antal hjärnor i en session och senare dissekera dem för en korrekt samling av flera hjärnregioner.

Korrekt insamling av hjärnregioner av intresse (ROIs) krävs ofta när man svarar på frågor relaterade till gen- och proteinuttryck. Medan farmakologi, elektrofysiologisk och optogenetik kan användas på vildtyp eller genetiskt modifierade gnagare för att belysa molekylära förändringar som ligger till grund för observerade beteenden^2,3,4, är mätning av inducerade förändringar i transkriptom och proteomer ofta används för att stödja dessa resultat. Tekniker som kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR), västra blotting, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ och HPLC⁷ är robusta och relativt låg i kostnad, vilket gör att många laboratorier att studera inducerad molekylära förändringar inom små hjärnregioner^2,4,5,6.

Det finns flera sätt att extrahera och rena nukleinsyra eller protein från^{hjärnregionerna 8,,9,,10,,11,12}. Många laboratorier skörda hjärnan regioner genom kylning och skära hjärnor på is vid tidpunkten för skörden^9,13. Även om detta tillvägagångssätt kan resultera i hög kvalitet nukleinsyra och protein, det är något tidsbegränsad som nedbrytning inom mikromiljön av vävnaden kan äga rum vid dessa temperaturer. Detta kan vara särskilt sant när man försöker dissekera ett stort antal djur eller rois i ett sammanträde. Att hålla prover frysta hjälper till att upprätthålla labila målmolekyler samtidigt som forskaren tid att noggrant jämföra landmärken på båda sidor av varje avsnitt i arbetet med att samla relativt rena prover. Laseravskiljning är ett annat sätt att samla vävnad för RNA eller proteinanalys från hjärnan områden¹⁰. Detta förfarande är överlägsen mekanisk dissekering i att mycket små och oregelbundet formade ROIs kan identifieras och isoleras. Laseravskiljning begränsas dock av användning av dyr utrustning och reagenser, är tidskrävande och kan också vara mer mottagliga för provförsämring.

Mikrospänndissektion på frusna vävnader är inte ny. Tidiga papper av Miklos Palkovits och andra beskriver de grundläggande teknikerna i detalj^14,15. Denna presentation följer till stor del det ursprungliga arbetet, med vissa förbättringar för att underlätta effektivitet och minska kostnaderna för den utrustning som behövs. Till exempel, hjärnan delar görs i en frusen hjärna block snarare än på en cryostat. Detta ger tjockare sektioner som minskar antalet avsnitt som behövs för att samla in ROI-prover. Denna metod dissekerar också prover på en frusen glasplatta som sitter på torris i en isolerad låda. Detta ger en underfrysning skede på bänken för att arbeta. Avsnitt som dissekeras på detta sätt är lätta att manipulera, vilket gör det möjligt för forskaren att jämföra båda sidor av varje avsnitt med en referens för att begränsa kontaminering från regioner utanför den önskade avkastningen på sysselsatt kapital.

Fördelar med detta protokoll är att 1) hjärnan hålls i ett fruset tillstånd under hela processen, vilket hjälper till att bevara protein och nukleinsyra och ger forskaren tid att noggrant skörda ROIs, och 2) reagenser som krävs är billiga och finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier. I denna process, hela hjärnor är sektionerade till 0,5-1,0 mm i en hjärna matris och placeras på en frusen glasplatta som kontinuerligt kyls med torris. Landmärken som finns i Allen Brain Atlas¹ eller andra hjärnatlass^16,17 används för att identifiera regioner av intresse, som sedan dissekeras med antingen en kall punch eller skalpell. Eftersom vävnaden aldrig tinas, regioner som skördas på detta sätt ger hög kvalitet RNA och protein för nedströms analyser.

Protocol

Djur som används i denna studie behandlades på ett etiskt och humant sätt som anges av Indiana University’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och National Institutes of Health (NIH) riktlinjer. OBS: Alla verktyg och ytor ska tvättas med ett lämpligt lösningsmedel för att avlägsna nukleaser18 innan något arbete påbörjas. 1. Förvaring av hjärnor Ta snabbt bort hjärnorna från avlivade vuxna CD1-vildtyps…

Representative Results

För att validera denna metod, den mediala prefrontala cortex samlades in från vuxna CD1 wildtype manliga möss och RNA och protein extraherades och karakteriserades. RNA analyserades av kapillär elektrofores. Degraderad RNA visar en förlust i intensiteten hos ribosomala banden 28S och 18S och visar även nedbrytningsprodukter som ett utstryk mellan 25 och 200 nukleotider (figur 5A, prov 1). RNA av hög kvalitet visar distinkta ribosomala band med liten eller ingen signal i området med l…

Discussion

Detta arbete beskriver en teknik för att isolera små, specifika regioner i hjärnan samtidigt begränsa nedbrytning av nukleinsyra och protein. Skador på hjärnvävnader sker snabbt när en organism dör. Detta beror delvis på en snabb uppbyggnad av extracellulär glutamat och den resulterande excitotoxikrititet som uppstår²¹. Messenger RNA är särskilt sårbara för nedbrytning^22,23. Nedbrytning av protein och nukleinsyra reduceras …

Materials

0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue