Summary
هنا نحن وصف طريقه موثوق بها لقياس الكتلة الميتوكوندريا والقدرة الغشاء في الخلايا الجذعية السابقة مثقف الجسم الدم والخلايا T.
Abstract
ان التوازن الدقيق بين السكون والتجديد الذاتي والتمايز هو المفتاح للحفاظ علي الخلايا الجذعية التي تكون الدم (HSC) والحفاظ علي الإنتاج مدي الحياة لجميع خلايا الدماء الناضجة. في السنوات الاخيره ظهرت الأيض الخلوية كمنظم حاسمه من وظيفة HSC ومصير. لقد أظهرنا سابقا ان تعديل الأيض الميتوكوندريا يؤثر مصير HSC. علي وجه التحديد ، من خلال تفكيك كيميائيا سلسله النقل الكترون كنا قادرين علي الحفاظ علي وظيفة HSC في الظروف الثقافية التي تحفز عاده التمايز السريع. ومع ذلك ، الحد من أرقام HSC غالبا ما يمنع استخدام الاختبارات القياسية لقياس الأيض HSC التالي التنبؤ وظيفتها. هنا ، ونحن الإبلاغ عن فحص التدفق الخلوي بسيطه التي تسمح قياس موثوق بها من المحتملة غشاء الميتوكوندريا وكتله الميتوكوندريا في الخلايا النادرة مثل HSCs. نناقش عزل HSCs من نخاع العظم الماوس وقياس الكتلة الميتوكوندريا والغشاء المحتملة آخر الثقافة المجرية السابقة. علي سبيل المثال ، ونحن نظهر تشكيل هذه المعلمات في HSCs عن طريق العلاج مع المغير الأيض. وعلاوة علي ذلك ، ونحن توسيع نطاق تطبيق هذه المنهجية علي الخلايا البشرية المستمدة من الدم الطرفية والأورام اللمفاوية الإنسان التسلل (TILs) ، والتي تبين الاختلافات المثيرة في لمحات الميتوكوندريا ، ربما تعكس الخلية T مختلفه وظيفه. ونحن نعتقد ان هذا الفحص يمكن ان تستخدم في العروض لتحديد مغيري الأيض الميتوكوندريا في أنواع مختلفه من الخلايا في سياقات مختلفه.
Introduction
الخلايا الجذعية للدم (HSCs) هي مجموعه صغيره من الخلايا المقيمة في نخاع العظم لضمان إنتاج الدم والتوازن طوال عمر الكائن الحي. HSCs التوسط في هذه العملية من خلال التخلي عن الأسلاف التي تنتج بدورها عضال متمايزة السلالات خلايا الدم الناضجة عبر عده جولات من انقسام الخلايا والتمايز جيدا مدبره الخطوات1. الأهم من ذلك ، HSCs تنتج طاقتها عبر تحلل لاهوائية. وعلي النقيض من ذلك ، فان المزيد من العاملين الملتزمينوالنشطين المولدينللدم يحولون ايضهم نحو استقلاب الميتوكوندريا 2،3،4. ويعتقد ان هذه الحالة الايضيه متميزة لحماية hscs من الاضرار الخلوية التي تسببها أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تنتجها الميتوكوندريا النشطة, التالي الحفاظ علي المدى الطويل في وظيفة الجسم الحيوي5,6,7,8. القياس المباشر لحاله الأيض HSC هو تحدي والانتاجيه في كثير من الأحيان منخفضه بسبب أرقامها المحدودة. هنا ، ونحن وصف الفحص القائم علي تدفق الخلوية لقياس قويه من المحتملة غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) باستخدام تيتراميثيلرودامين الميثيل استر (TMRM) فلوري ، وكتله الميتوكوندريا باستخدام وصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا (Mitotracker الأخضر) في HSCs. لقد أظهرنا سابقا ان انخفاض δψm هو علامة وظيفية حسن النية من hscs عاليه النقاء9 والتحوير الأيضي قادره علي خفض δψm تعزيز hscs وظيفة9،10. هنا نقترح استخدام طريقتنا علي التنميط الميتوكوندريا HSCs كاستراتيجية لتحديد جزيئات جديده قادره علي تحسين HSCs ' طويلة الأجل أعاده تشكيل الدم المحتملة.
علي سبيل المثال ، ونحن نثبت ان هذا الفحص يقيس بشكل موثوق خفض HSC ΔΨm عند التعرض لفيتامين B3 التناظرية نيكوتيناميد ريبوسيد (NR). وفقا لذلك ، في دراستنا التي نشرت مؤخرا ونحن نثبت ان NR يخفف بقوة الدم الانتعاش بعد الزرع في كل من الماوس وأنظمه الماوس أنسنه بتحسين مباشره الجذعية الدموية ووظائف سلف10. قدره هذه المغيرين الايضيه هي من القيمة السريرية كبيره بالنظر إلى ان معدل الوفاات 25 ٪ يرتبط بتاخير في الدم والتعافي المناعي في المرضي بعد زرع11،12.
وعلاوة علي ذلك ، ونحن نقدم أدله علي ان هذه المنهجية يمكن تطبيقها لتوصيف الشخصية الايضيه ووظيفة خلايا T الإنسان. في السنوات الاخيره ، أصبح تطوير العلاج الخلوي بالتبني (ACT) باستخدام الخلايا الليمفاوية اللمفاوية المتسللة (TILs) النهج الأكثر فعاليه لأنواع معينه من السرطان المتقدم مع التكهن غير المواتية للغاية (علي سبيل المثال ،سرطان الجلد المنتشر ، حيث > 50 ٪ من المرضي يستجيبون للعلاج ومع ذلك ، TILs إيواء ما يكفي من النشاط انتيورم من الصعب توليد14. الانتشار واسعه النطاق والتحفيز ان TILs الخضوع خلال التوسع الجسم السابق يسبب الإرهاق الخلية T والشيخوخة التي تضعف بشكل كبير T استجابه الخلية انتيورم15. الأهم من ذلك ، ترتبط قدره tils ' انتيتورال باحكام الأيض16،17 والنهج التي تهدف إلى تعدل الأيض من خلال تثبيط المسار PI3K/akt قد أنتجت نتائج مشجعه18،19. لهذا السبب, نقارن ΔΨm الخلايا T المستمدة من الخلايا أحاديه النواة الدم الطرفية (PBMCs) و TILs المستمدة من المريض, وتبين ان اقل تمايزا المستمدة من PBMCS الخلايا T لديها اقل ΔΨm وكتله الميتوكوندريا بالمقارنة مع TILs عضال متمايزة.
ونحن نتصور ان هذا الفحص يمكن استخدامها لتحديد المغيرين الايضيه الرواية التي تحسن HSC ووظيفة الخلية T عن طريق تشكيل ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب الموصوفة في المخطوطة تتبع المبادئ التوجيهية لمؤسستنا وتم تنفيذها وفقا للقانون السويسري للتجارب الحيوانية (الترخيص: VD3194) وللبحوث المتعلقة بعينات الإنسان (البروتوكول: 235/14 ؛ CER-VD 2017-00490)
1. استخراج الخلايا الجذعية للدم
- شراء الفئران نوع C57BL6/J البرية والاحتفاظ بها في منزل الحيوانية لمده أسبوع علي الأقل للحد من الإجهاد المرتبطة بالنقل.
- في يوم التجربة ، موت ببطء الماوس باستخدام الاختناق CO2 .
- رش الماوس مع 70 ٪ الايثانول لتعقيم الفراء وقطع فتح الماوس في البطن باستخدام الاداات الجراحية القياسية ، مثل مقص تشريح وملقط ، لقطع عظم الفخذ وعظم الساق من الساقين الخلفيتين.
- أزاله العضلات تعلق علي عظم الفخذ ، الساق ، والحوض باستخدام منشفه ورقيه لينه ووضع العظام التي تم تنظيفها في أنبوب 50 mL التي تحتوي علي برامج تلفزيونيه مع 1 مم أدتا (العازلة) علي الجليد.
- رش مدفع هاون ومدقه مع 70 ٪ الايثانول ووضعه في غطاء المحرك الثقافي للخلية. تعقيمها مع الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه. بعد التعقيم شطف هاون ومدقه مع العازلة لأزاله اثار الايثانول.
- وضع العظام نظيفه مع بعض العازلة (~ 10 مل) في هاون وسحق لهم بلطف للحصول علي نخاع العظم في التعليق. الآن ، وجمع تعليق الخلية وتمريرها من خلال مصفاه الخلية 70 μm في أنبوب 50 mL للحصول علي تعليق خليه واحده.
- كرر الخطوة 1.6 حتى يتم استخراج كل نخاع العظم والحطام العظام تحولت الأبيض.
- وضع أنبوب (s) 50 mL التي تحتوي علي نخاع العظم تعليق خليه واحده علي جهاز الطرد المركزي. تشغيل جهاز الطرد المركزي في 300 x g ل 10 دقيقه في 4 °c إلى بيليه الخلايا.
- وفي الوقت نفسه ، اعداد 10 مل من 1x تحلل العازلة في الماء المقطر معقمه. تصفيه الحل من خلال فلتر 0.22 μm.
- جمع أنبوب عينه من جهاز الطرد المركزي وصب في supernatant. ماصه 1x المخزن المؤقت تحلل (جدول المواد) علي بيليه الخلية. طرد بيليه واعداد حل متجانس عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا بضع مرات. السماح للأنبوب ان يكون في درجه حرارة الغرفة لمده 1-2 دقيقه لتحلل ار بي سي ان يحدث. إيقاف عمليه تحلل عن طريق ملء أنبوب مع المخزن المؤقت.
- وضع أنبوب علي جهاز الطرد المركزي وتدور في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه عن طريق أضافه 10 مل من العازلة وتصفيه الحل في أنبوب 50 mL جديده عن طريق مصفاه الخلية 70 μm لأزاله الحطام بسبب تحلل ار بي سي.
- الطرد المركزي أنبوب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 500 μL من المخزن المؤقت.
- أزاله قسامه 100 μl والاحتفاظ في أنبوب منفصل 1.5 mL. أضافه 50 μl من البيوتين سلاله الأجسام المضادة استنزاف كوكتيل من مجموعه الإثراء سلف (جدول المواد) إلى المتبقية 450 μl من تعليق الخلية. احتضان في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 15 دقيقه.
- أضافه 15 مل من العازلة والطرد المركزي الأنبوب في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 460 μL من المخزن المؤقت. أزاله 10 μl قسامه والاحتفاظ في أنبوب منفصل 1.5 mL.
- أضافه 50 μl من الخرز المغناطيسي العقديات من مجموعه الإثراء سلف (جدول المواد) ، إلى تعليق الخلية المتبقية 450 μl. احتضان في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 15 دقيقه.
- أضافه 15 مل من العازلة والطرد المركزي الأنبوب في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 5 مل من العازلة ونقل الحل إلى أنبوب 15 مل.
- خذ الأنبوب إلى فاصل الخلايا الألى (جدول المواد). تشغيل برنامج غسيل لشطف ورئيس أنابيب فاصل الخلية. وضع العينة واثنين من أنابيب جمع علي حامل أنبوب. تنفيذ الفصل باستخدام برنامج "تستنفد". جمع الكسور الموجبة والسالبة من فاصل الخلايا المؤتمتة بمجرد انتهاء التشغيل.
ملاحظه: في غياب فاصل الخلايا التلقائي يمكن للمستخدمين استخدام الاعمده المغناطيسية اليدوية والمغناطيس المقابلة ، في دليل المستخدم. يجب علي المستخدمين ان نضع في اعتبارنا ان عمليه الفصل اليدوي إبطا من الألى واحد. أيضا ، الاعمده اليدوية هي أكثر عرضه لانسداد. ولذلك ، ينصح المستخدمين لتخفيف العينة والتحميل علي العمود ببطء. - تجاهل الجزء الموجب. ملء أنبوب كسر السلبية مع العازلة. الطرد المركزي أنبوب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
- وفي الوقت نفسه ، واعداد مزيج الأجسام المضادة في 1 مل من حل حجم النهائي والضوابط أحاديه اللون في 200 μL من حل حجم النهائي كما هو موضح في جدول المواد والجدول 1.
ملاحظه: إذا كانت TMRM ووصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا هي التي سيتم الجمع بينها مع تلطيخ علامة الخلايا الجذعية ، ثم استبدال CD150 مع CD150-PEcy5 و العقديات مع الأحمر مع العقديات الدين باك البرتقالي. - جمع أنبوب عينه من جهاز الطرد المركزي وصب في supernatant. أعاده تعليق بيليه في 1 مل من مزيج الأجسام المضادة. أضافه 10 μL من الخلايا (من الخطوة 1.13) في كل من أنابيب التحكم أحاديه اللون (باستثناء النسب). أضافه 10 μL من الخلايا (من الخطوة 1.14) في أنبوب لون واحد السلالة.
- احتضان العينة وأنابيب التحكم أحاديه اللون في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 45 دقيقه. تغطيه دلو الجليد مع غطاء أو رقائق ألومنيوم.
- ملء جميع أنابيب مع العازلة والطرد المركزي في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 ° c. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق العينة في 1 مل من المخزن المؤقت وعناصر التحكم أحاديه اللون في 200 μl من المخزن المؤقت.
- نقل العينة وعناصر التحكم أحاديه اللون إلى 5 مل مرشح أنابيب FACS اعلي.
- تاخذ الأنابيب إلى اله الفرز وفرز السكان HSC (استراتيجية النابضة في الشكل 1ا) في أنابيب 1.5 mL التي تحتوي علي 400 μl من الخلايا الجذعية توسيع المتوسطة.
2. السابق فيفو الثقافة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم
- جمع الأنابيب التي تحتوي علي خلايا مفروزه (انظر القسم 1 لاستخراج الخلايا). الطرد المركزي أنابيب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c. برفق أزاله معظم ماده طافي دون التخلص من بيليه وترك 50-80 μl علي راس بيليه الخلية. وهذا يقلل من فقدان الخلايا.
- أعاده تعليق بيليه الخلية في متوسط توسيع الخلايا الجذعية إلى حجم نهائي يعتمد علي عدد الشروط التي يجب اختبارها (العد ل 100 μL لكل بئر/حاله الثقافة).
- اعداد الثقافة 2x المتوسطة التي تحتوي علي توسيع الخلايا الجذعية المتوسطة ، عامل الخلايا الجذعية (200 ng/ml) ، FLT3 يجند (4 نانوغرام/مل) والمضادات الحيوية القلم-بكتيريا (1 ٪) (2x المتوسطة القاعدية; جدول المواد).
- تاخذ ثقافة الانسجه المعقمة معالجه 96 لوحه البئر السفلي (جدول المواد) وتحديد الآبار حيث سيتم استزراع الخلايا (تصميم لوحه في الشكل 1ب).
ملاحظه: وينصح المستخدمين لتجنب الآبار الهامشية ، لأنها أكثر عرضه لتبخر. - وضع 100 μL من المتوسطة 2x القاعدية التي أعدت سابقا في الخطوة 2.3 في هذه الآبار. في NR ملحوظ أضافه 2 μL من محلول NR 100x (جدول المواد). تجديد NR كل 24 ساعة.
ملاحظه: التجديد محدد ل NR. قد المغيرين الأيض الأخرى أو قد لا تحتاج إلى تجديد. - البذور 100 μL من الخلايا التي أعدت في الخطوة 2.2 علي راس الآبار التي تحتوي علي 2x المتوسطة القاعدية. في هذه التجربة كان عدد HSCs المصنفة في بئر ما بين 800-1000 الخلايا.
- اعداد خمسه ابار اضافيه تحتوي علي 2x المتوسطة القاعدية. في كل من هذه أضافه 100,000 خلايا نخاع العظم الكامل (من الخطوة 1.13) أعاده تعليق في 100 μL من الخلايا الجذعية التوسع المتوسطة لاستخدامها كعناصر تحكم تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي بعد الثقافة.
ملاحظه: إذا كان المستخدمون يريدون الجمع بين علامات الخلايا الجذعية وعلامات الميتوكوندريا لتحليل ما بعد الثقافة فمن المستحسن ان فرز بالاضافه إلى ذلك السكان سلف (اما ckit + الخلايا أو LKSCD150). البذور هذه الأسلاف فرزها في الآبار السيطرة تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي بعد الثقافة. اعداد واحد جيدا لكل لون وصمه عار واحده. - وضع 200 μL من المياه المعقمة في جميع الآبار المحيطة للحد من التبخر من الآبار التي تحتوي علي الخلايا. ترك لوحه دون عائق في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده الفترة الثقافية (72 h). أزاله لوحه لتجديد NR كل 24 ح ووضعه مره أخرى في الحاضنة.
3. قياس الكتلة المتقدريه والاغشيه المحتملة
- في نهاية الفترة الثقافية اعداد محلول 100x من TMRM (20 μM) و Mitotracker الأخضر (10 μM) (الأخضر وصمه عار الفلورسنت) في الخلية الجذعية توسيعالمتوسطة (جدول المواد).
- أضافه 2 μL من الحل TMRM 100x و 2 μL من 100x الأخضر الحل وصمه عار الفلورسنت في كل من ابار الاختبار. أضافه 2 μL من 100x TMRM في التحكم TMRM جيدا. أضافه 2 μL من 100x الأخضر وصمه عار الفلورسنت في السيطرة Mitotracker جيدا. وضع لوحه مره أخرى في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 45 دقيقه تغطيه الأعلى من لوحه مع رقائق ألومنيوم.
ملاحظه: ويمكن اعداد عنصر تحكم إضافي مع فيراباميل (المثبط مضخة abc) إذا كانت مضخة abc بوساطة صبغ افلوكس يحتاج إلى اختبار. لهذا ، أضافه 50 μM فيراباميل في واحده من الآبار اختبار 1 ح قبل تلطيخ ل TMRM والأخضر وصمه عار الفلورسنت. - أزاله لوحه من الحاضنة والطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق عكس لوحه لأزاله supernatant. أضافه 200 μL من المخزن المؤقت FACS القياسية (برنامج تلفزيوني-1 مم أدتا-P/S-2 ٪) ، والطرد المركزي لوحه في 300 x g لمده 5 دقائق أزاله supernatant. كرر هذه الخطوة الغسيل 3x. يجب علي المستخدمين التاكد من ان يتم تغطيه لوحه دائما مع إحباط ، لتوفير الحد الأدنى من التعرض للضوء المباشر.
ملاحظه: إذا كان المستخدمون بحاجه إلى الجمع بين تلطيخ الميتوكوندريا مع تلطيخ الخلايا الجذعية ، فان العينة تحتاج إلى حضن مع مزيج من الأجسام المضادة من جميع علامات الخلايا الجذعية والضوابط أحاديه اللون سوف تحتاج إلى ان ملطخه الأجسام المضادة الفردية بشكل منفصل في 4 درجه مئوية لمده 30-45 دقيقه.
ملاحظه: في جميع الخطوات يجب علي المستخدمين الحفاظ علي لوحه مغطاه رقائق ألومنيوم. يجب علي المستخدمين ملاحظه ان هذه الخطوة تلطيخ اضافيه وخطوات الغسيل اللاحقة يمكن ان يؤدي إلى فقدان خلايا اضافيه. - أعاده تعليق الخلايا في 200 μL من المخزن المؤقت FACS ونقلها إلى أنابيب FACS.
- تشغيل العينات علي مقياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1). وتشمل أنابيب أحاديه اللون التي تحتوي علي WBM: (1) غير ملون ؛ (2) DAPI ؛ (3) TMRM (PE) ؛ (4) بقعه الفلورسنت الخضراء (FITC) ؛ (5) وصمه عار كامل (PE و FITC).
- أولا الحصول علي عناصر التحكم أحاديه اللون لاعداد الجهاز. استخدم البرنامج قيد التشغيل علي الجهاز لحساب التعويض. بمجرد تطبيق التعويض ، احصل علي عينه HSC وسجل أكبر عدد ممكن من الاحداث.
ملاحظه: إذا تم الجمع بين الخلايا الجذعية وعلامات الميتوكوندريا ، المستخدمين بحاجه إلى توخي الحذر بشكل خاص مع التعويض بين TMRM (PE) ، CD150 (PE-Cy5) ، و Sca-1 (APC). أيضا ، يجب تشغيل العينات مباشره بعد تلطيخ. - تصدير ملفات FACS من مقياس المضخم الخلوي وتحليل البيانات علي برنامج تحليل (جدول المواد).
- للتحليل ، افتح الملف علي برنامج التحليل. باستخدام FSC-A و SSC-A النابضة تحديد السكان الخلية. تحديد singlets في البوابات التالية قبل التخطيط لكسر DAPI السالب (الخلايا الحية). في بوابه الخلية الحية جعل مؤامرة كفاف في TMRM والخضراء وصمه عار الفلورسنت قناه لقياس ΔΨm والشامل ، علي التوالي (الشكل 2ا). تصدير متوسط كثافة مضان (مؤسسه مونتانيار) من هاتين القناتين في بوابه الخلية الحية.
- يتم تعيين بوابه منخفضه TMRM علي أساس السكان الكتف في قناه TMRM. يمكن استخدام عنصر تحكم TMRM أحاديه اللون للتعرف علي هذا العدد من الكتفين لتعيين البوابة. تصدير نسبه الخلايا الحية في بوابه منخفضه TMRM في التحكم وعينات الاختبار للتخطيط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 1 نعرض استراتيجية النابضة لعزل الخلايا الجذعية التي تكون الدم من نخاع العظم الماوس وتخطيط لوحه للثقافة الجسم السابق. ويبين الشكل 1الف تحديد الجزء اللمفاوي في SSC-a/FSC-مؤامرة. تمت أزاله المشككات في بوابه قميص متبوعا بتحديد الخلايا الحية بسبب عدم وجود اشاره dapi. تم تحديد السكان LKS ، المعرفة من قبل النسب-Sca1 +ckit +. ومن المعروف ان هذه السكان تحتوي علي الجذعية وخلايا السلف. تشكل HSCs حوالي 5 – 10% من الخلايا في السكان LKS وتم تحديدها بواسطةالCD150 +CD48- السكان. يمثل الشكل 1ب التصميم من ال [96-ول] لوحه ل [اكس] [فيفو] ثقافة. تم تصنيف HSCs تم فرزها في الظروف الثقافية المختلفة: في هذه الحالة ، والسيطرة والظروف الثقافية تكمله NR. كما تم أيضا طلاء خلايا نخاع العظم الكامل كعناصر تحكم أحاديه اللون كما هو موضح في البروتوكول. ومن المهم ملء جميع الآبار المحيطة بالمياه لتجنب تبخر الوسائط من الآبار المحتوية علي الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، وكما ذكر سابقا ، تم تجنب الآبار الهامشية لاستزراع الخلايا لأنها أكثر عرضه للتبخر.
ويبين الشكل 2 قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (δψm) والكتلة في ثقافة ما بعد hscs. يظهر الشكل 2A قطع تمثيليه من مستويات tmrm (أعلاه) والأخضر الفلورسنت الميتوكوندريا وصمه عار (أدناه) في hscs مثقف في السيطرة و NR تكمله الشروط. واظهر العلاج NR زيادة واضحة في عدد السكانمنخفضه tmrm. ويبين الشكل 2باء القياس الكمي من ثلاث عينات مستقله. العلاج NR زيادة كبيره في نسبه الخلايا في بوابهمنخفضه tmrm وأظهرت انخفاضا كبيرا في كثافة الفلورية tmrm. لم تتغير كتله الميتوكوندريا (ممثله بكثافة الأخضر فلوري) علي مكملات NR. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن مجتمعه الجذعية تلطيخ علامة الخلية مع الثقافة ما بعد تلطيخ الميتوكوندريا. يظهر الشكل 2ج استراتيجية النابض لتحديد hscs من النسب السلبية و lks السكان بعد الثقافة في ظروف الثقافة اثنين. وينظر إلى TMRM والأخضر الميتوكوندريا الفلورسنت وصمه عار من هذه HSCs بوابات في الشكل 2د. واظهر التعرض لل NR زيادة كبيره في النسبة المئوية لعدد السكانالمنخفض وانخفاضا كبيرا في كثافة الفلورية لل Tmrm في hscs المسورة. ظلت الاشاره الخضراء المتقدريه الفلورية الخضراء بدون تغيير في الحالتين.
ويبين الشكل 3 قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (δψm) والكتلة في الخلايا البشرية المختلفة t: خلايا كريات الدم الاحاديه الطرفية (pbmcct) و CD8 + الخلايا التائية ، فضلا عن الأوراماللمفاوية + و CD8 + ورم التسلل (TILS) بعد بروتوكول التوسع السريع (REP). يظهر الشكل 3الف قطع تمثيليه من مستويات tmrm (أعلاه) ومستويات البقع المتقدريه الفلورية الخضراء (أدناه) للتداول (pbmc)وخلايا CD8 + T التي تتسلل إلى الورم (TIL). وأظهرت TILs زيادة واضحة في TMRM والأخضر اشاره الفلورسنت الميتوكوندريا الفلورية مقارنه بالخلايا T المتداولة. يظهر الشكل 3ب التحديد الكمي لمؤسسه المؤسسات الخاصة وتلطيخ الميتوكوندريا الفلوري الأخضر. TILs عرض اعلي TMRM والأخضر النيون الفلورية تلطيخ الإشارات مقارنه مع الخلايا T المشتقة PBMC. وتشير هذه البيانات إلى ان TILs لديها الشخصية الايضيه المتميزة مع زيادة ΔΨm وكتله الميتوكوندريا.
الشكل 1: العزلة وثقافة الخلايا الجذعية التي تكون الدم. (ا) استراتيجية لعزل الخلايا الجذعية للدم (hscs) استنادا إلى علامات سطح الخلية. تم تحديد HSCs علي انها نسب-Sca1 + ckit + (lks)CD150 +CD48-. (ب) تصميم 96 لوحه جيده وضعت في الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: لمحات الميتوكوندريا من hscs. (ا) مؤامرة كفاف facs تظهر hscs نشر الثقافة في ظروف القاعدية أو NR تكمله. TMRM (أعلاه) والأخضر الفلورسنت الميتوكوندريا وصمه عار (Mitotracker) (أدناه) تظهر لمحات. (ب) القياس الكمي لل tmrm والاشاره الخضراء للبقع المتقدريه الفلورية. أدت مكملات NR في انخفاض في الملف الشخصي TMRM مع الحفاظ علي اشاره الفلورية الخضراء الميتوكوندريا وصمه عار. (ج) مخططات كفاف تبين هويه السكان الHSCين في السيطرة وتستكمل الشروط الخاصة بالثقافة اللاحقة. (د) مخططات الكفاف والقياس الكمي لل tmrm واشاره البقع الفلورية الخضراء المتقدريه في ثقافة ما بعد التنميط الظاهري hscs. مكملات NR خفضت اشاره TMRM في حين ظلت اشاره وصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا دون تغيير في HSCs. الطالب t اختبار * * *p < 0.001 ، * * p < 0.01 ، * p < 0.05 ، وليس > 0.05 كبيره ، وأشرطه الخطا = SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لمحات الميتوكوندريا من الإنسان pbmcms و tils: (ا) مؤامرة كفافالصورةالتي تظهرالCD8 + و + الطازجة معزولة من pbmcmcmcmccm+ المشتقة من الورم وCD8 + post REP (بروتوكول التوسع السريع). TMRM (أعلاه) والأخضر الفلورسنت الميتوكوندريا وصمه عار (Mitotracker) (أدناه) تظهر لمحات. (ب) القياس الكمي لل tmrm والاشاره الخضراء للبقع المتقدريه الفلورية. TILs عرض النشاط الميتوكوندريا السفلي والشامل. طالب t-اختبار * * *p < 0.001 ، * *p < 0.01 ، *p < 0.05 ، لا كبيره > 0.05 ، أشرطه الخطا = SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| S.No | اسم الجسم المضاد | تخفيف العمل |
| 1 | ستربتودين Tx احمر | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | ككيت PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| لاستخدامها فقط إذا كانت الخلايا الجذعية وعلامات الميتوكوندريا مجتمعه. | ||
| 6 | ستربتودين باك اورانج | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
الجدول 1: مخففات الأجسام المضادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنظيم المحكم لوظيفة HSC مهم للحفاظ علي الدم مستقره خلال حياه الكائن الحي. مثل مختلف أنواع الخلايا الأخرى في الجسم ، عنصرا رئيسيا يساهم في تنظيم وظيفة HSC هو الأيض الخلوي. الدراسات السابقة من مختبرنا9 وغيرها2,3 وقد تورطت في اهميه الميتوكوندريا في الحفاظ علي حاله الأيض متميزة في hscs. نظرا للعدد المنخفض للغاية من hscs معزولة من نخاع العظم murine ، فانه من الصعب تحليلها عن طريق اختبارات الأيض القياسية (مثل استهلاك الأكسجين مع فرس الحصان). استنادا إلى عملنا السابق ، قمنا بتوحيد فحص التدفق الخلوي البسيط لقياس إمكانات الكتلة والغشاء المتقدريه بشكل موثوق (قراءه غير مباشره للنشاط) في عدد قليل من الخلايا (اي HSCs). هذا الفحص يسمح قياس علي الخلايا الحية دون المساس صلاحيتها9، مما يجعلها متاحه لأي اختبارات وظيفية المصب (مثل cfus أو زرع نخاع العظم) التي قد يرغب المستخدمون في القيام به. ونحن نتوقع هذا الفحص المستخدمة في التجارب الفرز ، مما يسمح لقراءه سريعة علي الملف المتقدريه من HSCs من خلفيات وراثيه مختلفه أو نماذج الضربة القاضية. الأهم من ذلك ، يمكن الجمع بين المقايسة لدينا مع تلطيخ cfse ان يكون لها قراءات مزدوجة علي انتشار HSC والملف الشخصي المتقدريه9،10، والسماح لتحليل مصير الأيض من تقسيم hscs. النظر إلى انه من الصعب اجراء تلطيخ ونحن نعمل مع عدد قليل من الخلايا (hscs) ، فمن المهم ان آخر طرد المستخدمين ترك دائما 80-100 μl من الحل في الأنابيب من أجل تقليل فقدان الخلايا. بالاضافه إلى ذلك ، خلال جميع الخطوات تلطيخ آخر الأنابيب أو لوحات ينبغي ان تكون محمية من الضوء ، اما عن طريق تغطيه لهم في إحباط أو العمل في بيئة الاضاءه الخافتة. إذا قرر المستخدمون الجمع بين وصمه عار HSC مع الاصباغ الميتوكوندريا انها يجب ان تحقق ما إذا كان يتم تنفيذ التعويض بشكل صحيح ، وخصوصا بين TMRM (PE) ، PeCy5 ، و APC.
الأهم من ذلك ، وهو منشور الاخيره الاسئله استخدام الاصباغ الميتوكوندريا في HSCs لأنها قد تكون عرضه لضخ efflux. وتفيد هذه الدراسات ان معظم الأجزاء البدائية للدم لديها اعداد أكبر من الميتوكوندريا مقارنه بمقدمي السلف الملتزمين20. في تجربتنا ، واستخدام النماذج الجينية الماوس (ميتو eGFP الفئران21) ، الميتوكوندريا صبغ مستقله أساليب تلطيخ (TOM20 الأجسام المضادة) ، وتحليل qpcr يدعم فكره ان معظم مقصورات المكونة للدم البدائية لديها اقل محتوي الميتوكوندريا10. ونعتقد انه يتعين اجراء المزيد من الدراسات من أجل توضيح هذا التباين في الميدان.
في موازاة ذلك ، ونحن نثبت ان استخدام التنميط الميتوكوندريا يمكن استغلالها لتحديد اللياقة الايضيه من TILs الإنسان وتطوير استراتيجيات الأيض تهدف إلى استعاده وظيفة الخلايا T استنفدت. في الواقع ، الخلايا T معزولة من PBMCs عرض نشاط الميتوكوندريا السفلي (TMRM) والشامل (Mitotracker الأخضر) ، في حين ان الخلايا T أكثر استنفدت مثل TILs لديها اعلي النشاط الميتوكوندريا والكتلة ، مما يوحي بامكانيه أعاده برمجه الأيض التي تحدث اثناء الإرهاق. وفقا لذلك, وقد أظهرت الدراسات السابقة المنشورة التي الخلايا الجذعية مثل خليه الذاكرة t (tscm), الخلايا t مع تعزيز الثبات وقادره علي استجابه طويلة الأجل استدعاء, لديهم انخفاض δψm والعلاجات التي تستهدف الأيض خليه t يمكن ان تؤثر بقوة وظيفتها22,23.
وأخيرا ، نعتقد ان نهجنا يمكن ان يكون أداه قيمه لتحديد المركبات الجديدة التي يمكن إصلاح الاختلالات الوظيفية HSCs (مثل الشيخوخة أو الأورام الخبيثة الدموية) عن طريق استعاده لياقتهم الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد قدمت بعض عناصر هذا العمل كطلب P1828EP00 إلى المكتب الأوروبي للبراءات.
Acknowledgments
نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي UNIL علي دعمهم وخاصه الدكتور رومان بيديل. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه مؤسسه كريستيان غيرهارد جيسن المقدمة إلى الجمعية التاسيسيه
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
