Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow
Summary
Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.
Abstract
Um bom equilíbrio de quiescência, auto-renovação e diferenciação é fundamental para preservar a piscina de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e manter a produção ao longo da vida de todas as células sanguíneas maduras. Nos últimos anos, o metabolismo celular emergiu como um regulador crucial da função hsc e destino. Nós demonstramos previamente que a modulação do metabolismo mitocondrial influencia o destino de HSC. Especificamente, ao desacoplado quimicamente a cadeia de transporte de elétrons, fomos capazes de manter a função HSC em condições culturais que normalmente induzem a diferenciação rápida. No entanto, limitar os números do HSC muitas vezes impede o uso de ensaios padrão para medir o metabolismo do HSC e, portanto, prever sua função. Aqui, relatamos um ensaio de citometria de fluxo simples que permite a medição confiável do potencial da membrana mitocondrial e massa mitocondrial em células escassas, como HSCs. Discutimos o isolamento de HSCs da medula óssea do rato e a medição da massa mitocondrial e da cultura pós-vivo potencial de membrana. Como exemplo, mostramos a modulação desses parâmetros em HSCs por meio de tratamento com modulador metabólico. Além disso, ampliamos a aplicação dessa metodologia sobre células T derivadas do sangue periférico humano e linfocitos infiltrados de tumores humanos (TILs), mostrando diferenças dramáticas em seus perfis mitocondriais, possivelmente refletindo diferentes células T Funcionalidade. Acreditamos que este ensaio pode ser empregado em exames para identificar moduladores do metabolismo mitocondrial em vários tipos de células em diferentes contextos.
Introduction
As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são uma pequena população de células que residem na medula óssea, garantindo a produção sanguínea e a homeostase ao longo da vida útil de um organismo. HSCs mediar este processo, dando origem a progenitores que, por sua vez, produzem linhagens de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente através de várias rodadas de divisão celular e passos de diferenciação bem orquestrada1. É importante ressaltar que os HSCs produzem sua energia através da glicolíse anaeróbica. Em contraste, progenitores hematopoiéticos mais comprometidos e ativos mudam seu metabolismo para o metabolismo mitocondrial2,3,4. Acredita-se que este estado metabólico distinto proteja os HSCs de danos celulares infligidos por espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por mitocôndrias ativas, mantendo assim sua função in vivo de longo prazo5,6,7,8. A medição direta do estado metabólico do HSC é desafiadora e muitas vezes baixa taxa de rendimento devido aos seus números limitados. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em citometria de fluxo para a medição robusta do potencial da membrana mitocondrial (Δ Já demonstramos anteriormente que o baixo Δém é um marcador funcional de boa-fé de HSCs altamente purificados9 e moduladores metabólicos capazes de reduzir a função de MSCs9,10. Aqui propomos o uso de nosso método no perfil mitocondrial de HSCs como estratégia para identificar novas moléculas capazes de melhorar o potencial de reconstituição do sangue a longo prazo dos HSCs.
Como exemplo, demonstramos que este ensaio mede de forma confiável a redução do HSC Δm após a exposição à vitamina B3 analógico nicotinamida ribosía (NR). Assim, em nosso estudo recentemente publicado, demonstramos que a NR melhora fortemente o pós-transplante de recuperação do sangue em ambos os sistemas de camundongos de camundongos e de camundongos humanizados, melhorando diretamente o tronco hematopoiético e as funções progenitoras10. A capacidade de tais moduladores metabólicos é de grande valor clínico, considerando que uma taxa de mortalidade de 25% está ligada ao atraso no sangue e recuperação imunológica em pacientes pós-transplantados11,12.
Além disso, fornecemos evidências de que essa metodologia pode ser aplicada para a caracterização do perfil metabólico e função das células T humanas. Nos últimos anos, o desenvolvimento da terapia celular adotiva (ACT) usando tumor autólogo infiltrando linfócitos (TILs) tornou-se a abordagem mais eficaz para certos tipos de câncer avançado com prognóstico extremamente desfavorável (por exemplo, melanoma metastático, onde >50% dos pacientes respondem ao tratamento e até 24% dos pacientes têm regressão completa)13. No entanto, TILs que abrigam atividade antitumoral suficiente são difíceis de gerar14. A proliferação extensa e estimulação que as TILs sofrem durante a expansão ex vivo causam exaustão e senescência das células T que prejudicam drasticamente a resposta antitumoral de células T15. Importante, a capacidade antitumoral dos TILs é lig firmemente a seu metabolismo16,17 e as aproximações visadas modular o metabolismo com a inibição do caminho de PI3K/Akt produziram resultados encorajadores18,19. Por esta razão, comparamos o Δ, de células T derivadas de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e TILs de operários do paciente, e mostramos que as células T derivadas de PBMC menos diferenciadas têm menor massa de δe e mitocondrial em comparação com TILs terminalmente diferenciadas.
Nós imaginamos que este ensaio pode ser usado para identificar os moduladores metabólicos novos que melhoram a função da pilha de HSC e de T através da modulação de Δ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma regulamentação rigorosa da função do HSC é importante para manter a hematopoiese estável durante a vida de um organismo. Como vários outros tipos de células no corpo, um componente-chave que contribui para a regulação da função HSC é o metabolismo celular. Estudos anteriores do nosso laboratório9 e outros2,3 implicaram a importância das mitocôndrias na manutenção de um estado metabólico distinto em HSCs. Devido ao n?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Unil Flow Cytometry Core Facility pelo seu apoio, especialmente o Dr. Romain Bedel. Este trabalho foi apoiado pela concessão da fundação Kristian Gerhard Jebsen para n.v e o.n.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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