Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo
Summary
Aquí describimos un método confiable para medir la masa mitocondrial y el potencial de membrana en células madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo y células T.
Abstract
Un equilibrio fino de reposo, auto-renovación y diferenciación es clave para preservar la piscina de células madre hematopoyéticas (HSC) y mantener la producción de por vida de todas las células sanguíneas maduras. En los últimos años el metabolismo celular ha surgido como un regulador crucial de la función hSC y el destino. Hemos demostrado previamente que la modulación del metabolismo mitocondrial influye en el destino del HSC. Específicamente, al desacoplar químicamente la cadena de transporte de electrones pudimos mantener la función HSC en condiciones de cultivo que normalmente inducen una rápida diferenciación. Sin embargo, limitar los números de HSC a menudo impide el uso de ensayos estándar para medir el metabolismo de HSC y, por lo tanto, predecir su función. Aquí, informamos de un simple ensayo de citometría de flujo que permite la medición confiable del potencial de la membrana mitocondrial y la masa mitocondrial en células escasas como los HSC. Discutimos el aislamiento de los HSC de la médula ósea del ratón y la medición de la masa mitocondrial y el potencial de membrana después del cultivo ex vivo. Como ejemplo, mostramos la modulación de estos parámetros en hSC a través del tratamiento con un modulador metabólico. Además, ampliamos la aplicación de esta metodología en los linfocitos T derivados de la sangre periférica humana y los linfocitos infiltrantes de tumores humanos (TIL), mostrando diferencias dramáticas en sus perfiles mitocondriales, posiblemente reflejando diferentes células T Funcionalidad. Creemos que este ensayo se puede emplear en los exámenes para identificar moduladores del metabolismo mitocondrial en varios tipos de células en diferentes contextos.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son una pequeña población de células que residen en la médula ósea que aseguran la producción de sangre y homeostasis a lo largo de la vida útil de un organismo. Los HSC median este proceso dando lugar a progenitores que a su vez producen linajes de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente a través de varias rondas de división celular y pasos de diferenciación bien orquestados1. Es importante destacar que los HSC producen su energía a través de la glucólisis anaeróbica. Por el contrario, los progenitores hematopoyéticos más comprometidos y activos cambian su metabolismo hacia el metabolismo mitocondrial2,3,4. Este estado metabólico distinto se cree para proteger los HSC sin daño celular infligido por especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas por las mitocondrias activas, manteniendo así su función in vivo a largo plazo5,6,7,8. La medición directa del estado metabólico de HSC es desafiante y a menudo de bajo rendimiento debido a sus números limitados. Aquí, describimos un ensayo basado en citometría de flujo para la medición robusta del potencial de la membrana mitocondrial (m) utilizando fluorescencia del éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), y masa mitocondrial usando una mancha mitocondrial fluorescente verde (Mitotracker Green) en HSCs. Hemos demostrado previamente que el bajo-m es un marcador funcional de buena fidelidad de los HSC9 altamente purificados y moduladores metabólicos capaces de reducir la función de mejora de los HSCs9,10. Aquí proponemos el uso de nuestro método sobre el perfilado mitocondrial de HSCs como estrategia para identificar moléculas novedosas capaces de mejorar el potencial de reconstitución sanguínea a largo plazo de los HSC.
A modo de ejemplo, demostramos que este ensayo mide de forma fiable la reducción de la HSC- m en la exposición a la vitamina B3 riboside de nicotinamida analógica (NR). En consecuencia, en nuestro estudio recientemente publicado demostramos que NR mejora fuertemente la recuperación de sangre después del trasplante en los sistemas de ratón y ratón humanizado mejorando directamente el tallo hematopoyético y las funciones progenitoras10. La capacidad de estos moduladores metabólicos es de gran valor clínico teniendo en cuenta que una tasa de mortalidad del 25% está relacionada con el retraso en la sangre y la recuperación inmune en pacientes posttrasplantes11,12.
Además, proporcionamos evidencia de que esta metodología se puede aplicar para la caracterización del perfil metabólico y la función de las células T humanas. En los últimos años, el desarrollo de la terapia celular adoptiva (ACT) utilizando linfocitos infiltrantes tumorales autólogos (TIL) se ha convertido en el enfoque más eficaz para ciertos tipos de cáncer avanzado con pronóstico extremadamente desfavorable (por ejemplo, melanoma metastásico, donde >50% de los pacientes responden al tratamiento y hasta el 24% de los pacientes tienen regresión completa)13. Sin embargo, los TIL que albergan suficiente actividad antitumoral son difíciles de generar14. La amplia proliferación y estimulación que sufren los TIL durante la expansión ex vivo causan agotamiento de los tcelulares y senescencia que perjudican dramáticamente la respuesta antitumoral de los células T15. Es importante destacar que la capacidad antitumoral de los Til está estrechamente ligada a su metabolismo16,17 y los enfoques destinados a modular el metabolismo a través de la inhibición de la vía PI3K/Akt han producido resultados alentadores18,19. Por esta razón, comparamos el número de células T derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y TIL derivados del paciente, y demostramos que las células T menos diferenciadas de PBMC tienen una masa mitocondrial y de células mitocondriales más baja en comparación con los TIL diferenciados terminalmente.
Prevemos que este ensayo se puede utilizar para identificar nuevos moduladores metabólicos que mejoran la función de HSC y T a través de la modulación de la función de la célula T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una regulación estricta de la función HSC es importante para mantener una hematopoyesis estable durante la vida útil de un organismo. Al igual que varios otros tipos de células en el cuerpo, un componente clave que contribuye a la regulación de la función HSC es el metabolismo celular. Estudios previos de nuestro laboratorio9 y otros2,3 han implicado la importancia de las mitocondrias en el mantenimiento de un estado metabólico dist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Fondo de Citometría de Flujo de la UNIL su apoyo, especialmente al Dr. Romain Bedel. Este trabajo fue apoyado por la fundación Kristian Gerhard Jebsen a N.V y O.N.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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