Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie
Summary
Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.
Abstract
Ein feines Gleichgewicht aus Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung ist der Schlüssel, um den hämatopoetischen Stammzellpool (HSC) zu erhalten und die lebenslange Produktion aller reifen Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren hat sich der Zellstoffwechsel zu einem entscheidenden Regulator der HSC-Funktion und des Schicksals entwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels das Schicksal des HSC beeinflusst. Insbesondere konnten wir durch die chemische Entkopplung der Elektronentransportkette die HSC-Funktion unter Kulturbedingungen aufrechterhalten, die normalerweise eine schnelle Differenzierung induzieren. Die Begrenzung der HSC-Zahlen schließt jedoch häufig die Verwendung von Standard-Assays aus, um den HSC-Stoffwechsel zu messen und daher ihre Funktion vorherzusagen. Hier berichten wir über einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay, der eine zuverlässige Messung des mitochondrialen Membranpotenzials und der mitochondrialen Masse in knappen Zellen wie HSCs ermöglicht. Wir diskutieren die Isolierung von HSCs aus dem Knochenmark der Maus und die Messung von mitochondrialen Masse- und Membranpotenzialen nach ex vivo Kultur. Als Beispiel zeigen wir die Modulation dieser Parameter in HSCs über die Behandlung mit einem Metabolenmodulator. Darüber hinaus erweitern wir die Anwendung dieser Methode auf menschliche periphere, blutabgeleitete T-Zellen und menschliche Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die dramatische Unterschiede in ihren mitochondrialen Profilen aufweisen, die möglicherweise verschiedene T-Zellen widerspiegeln. Funktionalität. Wir glauben, dass dieser Assay in Screenings eingesetzt werden kann, um Modulatoren des mitochondrialen Stoffwechsels in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.
Introduction
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind eine kleine Population von Zellen, die im Knochenmark leben und die Blutproduktion und Homöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus gewährleisten. HSCs vermitteln diesen Prozess, indem sie Vorläufer hervorrufen, die wiederum endlos differenzierte reife Blutzelllinien über mehrere Zellteilungsrunden und gut orchestrierte Differenzierungsschritte1erzeugen. Wichtig ist, dass HSCs ihre Energie über anaerobe Glykolykose erzeugen. Im Gegensatz dazu schalten engagiertere und aktive hämatopoetische Vorläufer ihren Stoffwechsel in Richtung mitochondrialer Stoffwechsel2,3,4. Dieser ausgeprägte Stoffwechselzustand wird geglaubt, um die HSCs vor zellulären Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch aktive Mitochondrien verursacht zu schützen, wodurch ihre langfristige in vivo Funktion5,6,7,8. Die direkte Messung des HSC-Stoffwechselzustands ist eine Herausforderung und aufgrund ihrer begrenzten Anzahl oft geringer Durchsatz. Hier beschreiben wir einen strömungszytometriebasierten Assay zur robusten Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) mit Tetramethylrhodinmethylester (TMRM) Fluoreszenz und mitochondrialer Masse unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecks (Mitotracker Green) in HSCs. Wir haben bereits gezeigt, dass low ‘m ein bona-fide funktioneller Marker von hochgereinigten HSCs9 und metabolischen Modulatoren ist, die in der Lage sind, die HSCs-Funktion9,10zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung unserer Methode auf HSCs mitochondriale Profilierung als Strategie zur Identifizierung neuartiger Moleküle vor, die in der Lage sind, das langfristige Rekonstitutionspotenzial der HSCs zu verbessern.
Als Beispiel zeigen wir, dass dieser Assay zuverlässig die Senkung von HSC-M bei Exposition gegenüber Vitamin B3-analogem Nicotinamid-Ribosid (NR) misst. Dementsprechend zeigen wir in unserer kürzlich veröffentlichten Studie, dass NR die Blutrückgewinnung nach der Transplantation sowohl in Maus- als auch in humanisierten Maussystemen stark verbessert, indem es die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferfunktionen direkt verbessert10. Die Kapazität solcher metabolischen Modulatoren ist von großem klinischen Wert, wenn man bedenkt, dass eine 25% Sterberate mit Verzögerungen bei der Blut- und Immunregeneration bei posttransplantierten Patienten verbunden ist11,12.
Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass diese Methode für die Charakterisierung des metabolischen Profils und der Funktion menschlicher T-Zellen angewendet werden kann. In den letzten Jahren ist die Entwicklung der Adoptivzelltherapie (ACT) mit autologen Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zum effektivsten Ansatz für bestimmte Arten von fortgeschrittenem Krebs mit extrem ungünstiger Prognose (z. B. metastasierendes Melanom, bei dem >50% der Patienten auf eine Behandlung ansprechen und bis zu 24% der Patienten eine vollständige Regression haben)geworden. TiLs, die eine ausreichende Antitumoraktivität haben, sind jedoch schwierig,14zu erzeugen. Die umfangreiche Proliferation und Stimulation, die TILs während der Ex-vivo-Expansion erfahren, verursacht T-Zell-Erschöpfung und Seneszenz, die die T-Zell-Antitumorreaktion dramatisch beeinträchtigen15. Wichtig ist, dass die antitumorale Kapazität der TILs eng mit ihrem Stoffwechsel16,17 verbunden ist und Ansätze, die darauf abzielen, den Stoffwechsel durch die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs zu modulieren, ermutigende Ergebnisse hervorgebracht haben18,19. Aus diesem Grund vergleichen wir die von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und patientenabgeleiteten TILs gewonnenen T-Zellen und zeigen, dass weniger differenzierte PBMC-abgeleitete T-Zellen eine niedrigere Und mitochondriale Masse aufweisen als endlos differenzierte TILs.
Wir stellen uns vor, dass dieser Assay verwendet werden kann, um neuartige metabolische Modulatoren zu identifizieren, die die HSC- und T-Zellfunktion durch die Modulation von m verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine strenge Regulierung der HSC-Funktion ist wichtig, um eine stabile Hämatopoese während der Lebensdauer eines Organismus aufrechtzuerhalten. Wie verschiedene andere Zelltypen im Körper ist ein Schlüsselbestandteil, der zur Regulierung der HSC-Funktion beiträgt, der Zellstoffwechsel. Frühere Studien aus unserem Labor9 und anderen2,3 haben die Bedeutung von Mitochondrien für die Aufrechterhaltung eines ausgeprägten Stoffwechselzus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der UNIL Flow Cytometry Core Facility für ihre Unterstützung, insbesondere Dr. Romain Bedel. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der Kristian Gerhard Jebsen Stiftung an N.V. und O.N. unterstützt.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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