Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso
Summary
Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell’ex vivo e nelle cellule T.
Abstract
Un raffinato equilibrio di quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione è fondamentale per preservare il pool di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e mantenere la produzione permanente di tutte le cellule del sangue mature. Negli ultimi anni il metabolismo cellulare è emerso come un regolatore cruciale della funzione ESC e del destino. Abbiamo dimostrato in precedenza che la modulazione del metabolismo mitocondriale influenza il destino HSC. In particolare, sganciando chimicamente la catena di trasporto degli elettroni siamo stati in grado di mantenere la funzione HSC in condizioni di coltura che normalmente inducono una rapida differenziazione. Tuttavia, limitare i numeri HSC spesso preclude l’uso di saggi standard per misurare il metabolismo hSC e quindi prevedere la loro funzione. Qui, segnaliamo un semplice saggio di citometria di flusso che consente la misurazione affidabile del potenziale della membrana mitocondriale e della massa mitocondriale in cellule scarse come gli HSC. Discutiamo l’isolamento degli HSC dal midollo osseo del topo e la misurazione della massa mitocondriale e della membrana potenziale cultura post ex vivo. Ad esempio, mostriamo la modulazione di questi parametri in HSC tramite il trattamento con un modulatore metabolico. Inoltre, estendiamo l’applicazione di questa metodologia sulle cellule T derivate dal sangue periferico umano e sui linfociti infiltranti del tumore umano (TIL), mostrando differenze drammatiche nei loro profili mitocondriali, probabilmente riflettendo diverse cellule T Funzionalità. Crediamo che questo saggio possa essere impiegato negli screening per identificare i modulatori del metabolismo mitocondriale in vari tipi di cellule in contesti diversi.
Introduction
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono una piccola popolazione di cellule che risiedono nel midollo osseo che assicurano la produzione di sangue e l’omeostasi per tutta la vita di un organismo. Gli HSC mediano questo processo dando origine a progenitori che a loro volta producono lignaggi di cellule del sangue mature differenziate terminalmente tramite diversi cicli di divisione cellulare e passaggi di differenziazione ben orchestrati1. È importante sottolineare che gli HSC producono la loro energia attraverso la glicolisi anaerobica. Al contrario, i progenitori ematopoietici più impegnati e attivi cambiano il loro metabolismo verso il metabolismo mitocondriale2,3,4. Si ritiene che questo stato metabolico distinto protegga gli HSC dai danni cellulari inflitti dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS) prodotte dai mitocondri attivi, mantenendo così la loro funzione in vivo a lungo termine5,6,7,8. La misurazione diretta dello stato metabolico HSC è impegnativa e spesso bassa produttività a causa del loro numero limitato. In questo caso, descriviamo un saggio basato sulla citometria di flusso per una misurazione robusta del potenziale della membrana mitocondriale (m) usando la fluorescenza di tetrametilrhodamie (TMRM) e la massa mitocondriale usando una macchia mitocondriale verde (Mitotracker Green) negli HSC. In precedenza abbiamo dimostrato che il basso zofm è un marcatore funzionale in buona fede di HSC9 altamente purificati e modulatori metabolici in grado di abbassare lafunzioneHSC, 9,10. Qui proponiamo l’uso del nostro metodo sulla profilazione mitocondriale degli HSC come strategia per identificare nuove molecole in grado di migliorare il potenziale di ricostituzione del sangue a lungo termine degli HSC.
Ad esempio, dimostriamo che questo test misura in modo affidabile l’abbassamento dell’HSC , che si snoda dopo l’esposizione al riboside alla nicotina analogico di vitamina B3 (NR). Di conseguenza, nel nostro studio recentemente pubblicato dimostriamo che NR migliora fortemente il recupero del sangue posttrapianto in entrambi i sistemi murini e minorati migliorando direttamente le funzioni di stelo e progenitore ematopoietico10. La capacità di tali modulatori metabolici è di grande valore clinico considerando che un tasso di mortalità del 25% è legato al ritardo nel sangue e al recupero immunitario nei pazienti post-trapiantati11,12.
Inoltre, forniamo la prova che questa metodologia può essere applicata per la caratterizzazione del profilo metabolico e della funzione delle cellule T umane. Negli ultimi anni, lo sviluppo della terapia cellulare adottiva (ACT) utilizzando l’infiltrazione autologica del tumore dei linfociti (TIL) è diventato l’approccio più efficace per alcuni tipi di cancro avanzato con prognosi estremamente sfavorevole (ad esempio, melanoma metastatico, dove >50% dei pazienti risponde al trattamento e fino al 24% dei pazienti ha una regressione completa)13. Tuttavia, i TIL che ospitano un’attività antitumorale sufficiente sono difficili da generare14. L’estesa proliferazione e stimolazione che i TIL subiscono durante l’espansione ex vivo causano l’esaurimento e la senescenza delle cellule T che compromettono drammaticamente la risposta antitumorale delle cellule T15. È importante sottolineare che la capacità antitumorale dei TIL è strettamente legata al loro metabolismo16,17 e approcci volti a modulare il metabolismo attraverso l’inibizione del percorso PI3K/Akt hanno prodotto risultati incoraggianti18,19 . Per questo motivo, confrontiamo le cellule T derivate dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e i TIL derivati dal paziente, e mostriamo che le cellule T derivate da PBMC meno differenziate hanno una massa t-m e mitocondriale inferiore rispetto ai TIL differenziati terminalmente.
Ipotichiamo che questo assaggio possa essere utilizzato per identificare nuovi modulatori metabolici che migliorano la funzione delle cellule HSC e T attraverso la modulazione di zm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una stretta regolazione della funzione HSC è importante per mantenere l’ematopoiesi stabile durante la vita di un organismo. Come vari altri tipi di cellule nel corpo, un componente chiave che contribuisce alla regolazione della funzione HSC è il metabolismo cellulare. Studi precedenti dal nostro laboratorio9 e altri2,3 hanno implicato l’importanza dei mitocondri nel mantenere uno stato metabolico distinto negli HSC. A causa del numero e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’UNIL Flow Cytometry Core Facility per il loro sostegno, in particolare il Dr. Romain Bedel. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Kristian Gerhard Jebsen a N.V e O.N.
Materials
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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