Summary
Det presenterade protokollet använder flödecytometri för att kvantifiera antalet prolifererande och döda celler i odlade musenteroider. Denna metod är användbar för att utvärdera effekterna av läkemedelsbehandling på organoid spridning och överlevnad.
Abstract
Tarmepitelfungerar som en barriär som förhindrar luminalt innehåll, såsom patogent mikrobiota och toxiner, från att komma in i resten av kroppen. Epitelial barriärfunktion kräver integriteten hos tarmepitelceller. Medan epitelial cell spridning upprätthåller ett kontinuerligt lager av celler som bildar en barriär, epitelial skada leder till barriär dysfunktion. Som ett resultat kan luminalinnehåll över tarmbarriären via en obegränsad väg. Dysfunktion av tarmbarriären har associerats med många tarmsjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom. Isolerade mus tarmkryptoter kan odlas och upprätthållas som krypt-villus-liknande strukturer, som kallas intestinalorganoider eller "enteroids". Enteroids är idealiska för att studera spridningen och celldöd av intestinala epitelceller in vitro. I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att kvantifiera antalet proliferativa och döda celler i odlade enteroider. 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) och propidiumjodid används för att märka prolifererande och döda celler i enteroider, och andelen prolifererande och döda celler analyseras sedan av flödecytometri. Detta är ett användbart verktyg för att testa effekterna av läkemedelsbehandling på intestinalepitelial cellspridning och cellöverlevnad.
Introduction
En grundläggande funktion av intestinala epitelceller är att skydda inträdet av luminalinnehåll såsom patogena bakterier och gifter1,2. För att utföra en sådan funktion förökar sig tarmstamceller kontinuerligt och skiljer sig åt i en mängd olika epitelceller, inklusive enterocyter och sekretoriska celler, som bildar en barriär genom att bilda snäva anslutningar3. Snabb förnyelse av intestinala epitelceller kräver strikt samordning av cellproliferation, celldifferentiering och celldöd4,5. Minskad cellspridning eller överdriven celldöd leder till epitelial skada och komprometterande barriärfunktion1,6. Dysfunktion av tarmbarriären har associerats med inflammatoriska tarmsjukdomar7,8.
En metod för att odla tarmkryptor har utvecklats tidigare. Med hjälp av denna teknik, isolerade mus kryptor växa till intestinala organoider (enteroids), som har kryptan-villus liknande strukturer och innehåller alla intestinala epitelial cell härstamning9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) är en tymidin analog som kan ersätta thymine (T) i DNA som genomgår replikation under cellproliferation. De proliferativa cellerna kan snabbt och korrekt märkas av EdU färgning. Propidium jodid (PI) är en analog av ethidiumbromid som frigör röd fluorescens vid insättning i dubbelsträngat DNA. PI upptäcker specifikt döda celler, eftersom det bara passerar genom det skadade cellmembranet.
I detta protokoll beskriver vi först hur man isolerar kryptor från murintunntarmen och kulturen dem som enteroider in vitro. Vi beskriver sedan hur man analyserar proliferativa och döda celler i enteroids av EdU och PI införlivande och flöde cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Animal Care and Use Committee of Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) vid Soochow University.
1. Tarmorganoid Isolering och kultur
- Isolering av tarmkryptor och enteroid kultur
- Avliva en 8 veckor gammal vild-typ mus med CO2 inandning. Använd vävnadspincett och fin irissax för att dissekera cirka 8 cm ileum.
- Spola ut med en spruta med sondmatningsnål med ca 40 ml iskallt Dulbeccos fosfatbuffrad kokskokt koks (DPBS), skär sedan på längden med sax och öppna ileum.
- Skär ileum i små (0,5−1,0 cm) bitar. Placera bitarna i 5 ml steril iskalla DPBS i en 15 ml konisk tub, sedan klippa i 5 min på is.
- Använd en pipettstyrenhet för att aspirera DPBS och ersätta den med 10 ml kall buffert 1 (2 mM EDTA i DPBS). Rock i 30 min på is.
- Använd pipettstyrenheten för att aspirera buffert 1 och byt ut med 10 ml kall buffert 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sackaros i DPBS). Skaka i 2−3 min för hand (~80 shakes/min).
- Ta en 20 μL droppe buffert 2 innehåll efter skakningar och inspektera under ett mikroskop.
- Filterbuffert 2 innehåll med en 70 μm steril cellsil och samla sedan den filtrerade bufferten med ett koniskt rör på 50 ml.
- Pipette 20 μL filtrate t i bilden för att räkna krypterna. Överför en tillräcklig volym buffert 2 från steg 1.1.7 för att säkerställa att det finns ~ 500 kryptor / brunn.
- Snurra ner vid 150 x g i 10 min vid 4 °C. När spinning är klar, försiktigt aspirera supernatant.
- Häng kryptor i 50 μL av källaren membran matris (t.ex. Matrigel) per 500 kryptor, pipett upp och ner (var noga med att undvika bubblor), placera sedan en 50 μL droppe källare membran matris / krypta blandning i mitten av en brunn i en 24 väl tallrik. Inkubera i 30 min vid 37 °C för att polymerisera källaren membran matris.
- Efter 30 min polymerisation, tillsätt noggrant 600 μl minigutmedia (avancerat Dulbeccos modifierade Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanin-L-glutamin, penna/strep [100 enheter/ml], 10 mM Hepes, N2 tillägg [1:100], B27 tillägg [1:50] med epidermal tillväxtfaktor [EGF; 50 ng/ml], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], och Y27632 [10 μM]) till varje brunn, sedan tillbaka plattan till 37 °C inkubator. Observera under ett mikroskop varje dag och byt media var 2−3:e dag.
- Enteroid passaging
OBS: För långa kulturer bör enteroider delas ungefär varje vecka.- För att passage enteroids, placera vävnaden kultur plattan på is. Aspirera media och tillsätt 1 ml kall DPBS till varje brunn. Använd en P1000 spets för att pipette upp och ner tills ingen solid källare membran matris bitar kvar.
- Passera upp och ner en gång genom en 1 ml insulinspruta (27 G) och in i ett koniskt 15 ml-rör. Snurra ner i 5 min vid 150 x g vid 4 °C.
- Använd pipett för att ta bort DPBS. Omblandas i 50 μL av källaren membran matris / brunn.
- Placera plattan i en 37 °C-inkubator i 30 min så att källarenmembranmatrisen kan polymerisera. Överlägg var och en brunn med 600 μl ENR-media (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), sedan tillbaka plattan till inkubatorn.
2. Flödescytometri Analys av edu-positiva celler i Enteroids
Figur 1 visar arbetsflödet för flödescytometrianalys av EdU-positiva celler i enteroider.
- Inkubation av enteroider med EdU
- Odla enteroids från steg 1.2.4 för 5–7 dagar. Passage enteroids i en ny 24 brunnsplatta i ett delningsförhållande på 1:2. Tillsätt 600 μl ENR medium till varje brunn. Inkubera enteroids för 4−5 dagar i en 37 °C inkubator.
- Ställ in kontrollgruppen (obehandlade enteroider) och experimentell grupp (enteroids som behandlats med 5 ng/ml interleukin 22 [IL-22]). Förbered minst tre repliker för varje grupp.
- Tillsätt EdU till ENR-mediet för att förbereda EdU-mediet med en koncentration på 50 μM. Tillsätt 600 μl EdU-medium till varje brunn och inkubera i 2 timmar i en inkubator på 37 °C. Ställ in en brunn av enteroids utan EdU behandling som en negativ kontroll för bakgrund subtraktion.
- Skörd av enteroids från källaren membran matris
- Använd en pipettstyrenhet för att aspirera EdU-medium och tvätta 1x med DPBS. Lägg till 1 ml DPBS.
- Använd P1000 pipett spets och pipette upp och ner tills ingen solid källare membran matris bitar kvar. Överför till ett 15 mL-rör och snurra ner på 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 500 μL celldissociationsenzymer(Materialförteckning)och inkubera i 15 min vid 37 °C. Använd P200 pipett spets och pipett e upp och ner för att bryta enteroids i enstaka celler.
- Tillsätt 3 ml DMEM medium som innehåller 10% fetalt nötkreatur serum (FBS) och upprepade gånger pipette med en P1000 pipett spets.
- Snurra ner på 300 x g i 5 min och aspirera det supernatant mediet. Omblanda cellerna med 1 ml DPBS.
- Fixering och permeabilisering av celler
- Överför cellupphängningen till ett 1,5 ml-rör, snurra ner vid 300 x g i 5 min och kassera supernatanten.
- Resuspend celler med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA), fixa i 15 min vid rumstemperatur (RT), och snurra ner på 300 x g i 5 min. Aspirera supernatanten med en pipettspets, tvätta 1x med DPBS och snurra ner för att ta bort supernatanten.
- Omblanda celler med 1 ml 0,5% nonionic ytaktivt ämne. Inkubera i 10 min på RT.
- Snurra ner på 300 x g i 5 min och aspirera supernatanten. Tvätta 1x med DPBS och snurra ner för att ta bort supernatant.
- Upptäckt av EdU
- Förbered lagerlösningar för varje komponent i förväg: 1) arbetslösning av Alexa Fluor azide, 2) arbetslösning av 1x EdU reaktionbuffert, och 3) 10x lager lösning av EdU buffert tillsatsen.
- Förbered 1x EdU bufferttillsats genom att späda ut 10x lösning 1:10 i avjoniserat vatten. Förbered den här lösningen färsk.
- Förbered reaktionscocktail enligt tabell 1.
Obs! Använd reaktionscocktailen inom 15 min efter beredning. - Tillsätt 100 μl reaktioncocktails till varje 1,5 ml-rör. Omblanda cellerna, skydda mot ljus, inkubera i 30 min vid RT.
- Centrifug vid 300 x g i 5 min och aspirera reaktionslösningen med pipettspets försiktigt.
- Tillsätt 0,5% nonionic ytaktivt penetrant till varje rör för att tvätta 1x vid RT. Centrifug på 300 x g i 5 min, aspirera supernatanten med pipettspets försiktigt och ompausa cellerna i 1 ml DPBS.
- Analys av celler genom flödecytometri
- Filtrera de resuspenderade cellerna med en 40 μm sil och samla sedan de filtrerade cellerna med ett koniskt 15 ml-rör. Utför FACS på maskindetektering så snart som möjligt.
OBS: Om förhållandena är begränsade ska cellfärgade prover förvaras i mörker vid 4 °C och flödestestad inom 3 dagar. - Välj lämplig kanal (enligt typen av Alexa Fluor azide i EdU-satsen; här, röd kanal) och spänning (här, ~150–350 V) för flödescytometrianalys.
- Gating strategi
- Rita en FSC-A (x-axel) jämfört med SSC-A (y-axel) pseudocolor plot och distribuera de flesta av cellerna till det synliga området på punktkartan genom att justera spänningen. Markera cellpopulationen (R1) och uteslut cellskräpet i det nedre vänstra hörnet.
- Från R1-cellpopulationen upprättar du en FSC-A (x-axel) jämfört med. FSC-H (y-axel) pseudocolor-plot och ställ in porten för att välja enstaka celler (R2) för att utesluta cellklumpar.
- Från R2-cellpopulationen, fastställa fluorescensintensiteten (x-axeln) jämfört med. cellnummer (y-axel) och använd den negativa kontrollen för att ställa in porten. Regionen av fluorescerande signalär en positiv cellregion (R3). Jämför förhållandet mellan EdU-positiva celler (R3) mellan experimentella och kontrollgrupper.
- Filtrera de resuspenderade cellerna med en 40 μm sil och samla sedan de filtrerade cellerna med ett koniskt 15 ml-rör. Utför FACS på maskindetektering så snart som möjligt.
3. Flödecytometri Analys av PI-positiva celler i Enteroids
Figur 2 visar arbetsflödet för flödescytometrianalys av PI-positiva celler i enteroider.
- Inkubation av enteroida celler med PI
- Odla enteroids från steg 1.2.4 för 5–7 dagar. Passage enteroids i en ny 24 brunnsplatta i ett delningsförhållande på 1:2. Tillsätt 600 μl ENR medium till varje brunn. Inkubera enteroids för 4−5 dagar i en 37 °C inkubator.
- Ställ in kontrollgruppen (obehandlad) och experimentell grupp (IL-22 behandlade) med minst tre repliker för varje grupp.
- Tillsätt PI till ENR-mediet för att förbereda PI-medium med en koncentration på 3 μM.
- Tillsätt 600 μl PI-medium till varje brunn och inkubera i 30 min i en inkubator på 37 °C. Ställ in en brunn av enteroids utan PI-behandling som en negativ kontroll för bakgrundssubtraktion.
- Skörda enteroids från källaren membran matris följande steg 2.2.1−2.2.5.
- Analys av celler genom flödecytometri
- Filtrera de resuspenderade cellerna med en 40 μm sil och samla de filtrerade cellerna med ett koniskt 15 ml-rör.
- Utför FACS på maskindetektering så snart som möjligt.
OBS: Om förhållandena är begränsade ska cellfärgade prover förvaras i mörker vid 4 °C och flödestestad inom 3 dagar. - Välj lämplig kanal (här, röd kanal) och spänning (här, ~ 150–350 V) för flödescytometrianalys.
- Använd samma strategi som beskrivs i avsnitt 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Små tarmkryptor isolerades och odlades som enteroids i källaren membran matris. Enteroids började bilda knoppar 2 dagar efter isolering. Dag 6 hade enteroids många knoppar med massor av skräp (döda celler) i lumen. Enteroids var redo att passage i detta skede (Figur 3).
Många studier har visat att inflammatoriska cytokiner är viktiga för underhåll av intestinalepitelial homeostas. Onormaluttryck av inflammatoriska cytokiner är nära förknippad med förekomsten av inflammatoriska tarmsjukdomar11. Till exempel visade vår tidigare studie att IL-22 främjar spridning av transitförstärkande celler men också utarmat Lgr5+ stamceller12.
Enteroids behandlades med IL-22 i 3 dagar, varefter syntetiska DNA var märkt med EdU för att indikera cellspridning. IL-22-behandlade enteroider visade ett ökat antal EdU+ celler(figur 4A). IL-22 ökade prolifererande celler från 40,1% till 83,5% som analyseras av flödecytometri (Figur 4B). IL-22 behandling ökade också celldöd i enteroider, indikerade av PI färgning(figur 5A). IL-22 ökade döda celler från 4,9% till 16,2% som analyseras av flödecytometri (Figur 5B).
Figur 1: Arbetsflödesdiagram för flödescytometrianalys av EdU-positiva celler i enteroider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arbetsflödesdiagram för flödescytometrianalys av PI-positiva celler i enteroider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Brightfield bilder av enteroids på 2, 4 och 6 dagar efter kryptan isolering. Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: IL-22 ökar spridningen av enteroids. (A)Enteroids odlades i medium utan eller med IL-22 (5 ng/ml) i 3 dagar och inkuberades med EdU (röd) i 1 h. Skalbar = 100 μm. (B) Flödecytometridata från enteroider odlade utan (vänster) eller med (höger) IL-22. Uppgifterna är representativa för tre separata experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: IL-22 främjar celldöd i enteroider. (A)Enteroids odlades i medium utan eller med IL-22 (5 ng/ml) i 3 dagar och färgades med propidiumjodid (röd). Skalstång = 100 μm. (B) Flödecytometridata från enteroider odlade utan (vänster) eller med (höger) IL-22. Uppgifterna är representativa för tre separata experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reaktionskomponenter | Antal brunnar av 24-brunnsplattor | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x Reaktionbuffert | 86 μl | 172 μl | 430 μl | 860 μl | 1,72 μL | 4,3 μl |
| CuSO4 (på 1960-) | 4 μl | 8 μl | 20 μl | 40 μl | 80 μl | 200 μl |
| Alexa Fluor azide | 0,25 μl | 0,5 μl | 1,25 μl | 2,5 μl | 5 μl | 12,5 μL |
| Tillsats av reaktionsbuffert | 10 μl | 20 μl | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 500 μl |
| Total volym | 100 μl | 200 μl | 500 μl | 1 μl | 2 μl | 5 μl |
| Obs! | ||||||
Tabell 1: EdU reaktion cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för kulturen av enteroider in vitro och kvantifiering av EdU- och PI-positiva celler i enteroids av flöde cytometri. Det finns flera fördelar med denna strategi. För det första används EdU-märkning för att upptäcka prolifererande celler i enteroider. Jämfört med traditionell BrdU-analys är EdU-märkningsmetoden snabbare, känsligare och mer exakt. EdU är mycket lik thymine (T), som ersätter thymine i DNA-syntes under celldelning. Jämfört med BrdU-antikroppen är EdU lättare att sprida sig in i cellen, och detektion av EdU kräver inte DNA-denaturering och en antigen-antikroppsreaktion. För det andra kan flödecytometri analys snabbt och exakt kvantifiera de föröka (EdU+) och döda (PI+) celler i enteroider.
För att kunna utföra hela proceduren finns det kritiska aspekter att överväga. För det första är det viktigt att kulturen enteroids under tillräckliga förhållanden. Välodlade enteroids bör ha gott om knoppar, som innehåller proliferative celler. För det andra är det viktigt att dela enteroids i tid. Skräp som ackumuleras i lumen innehåller döda celler, som kan färgas med PI. Detta är skadligt för följande flödecytometri analys. För det tredje, på grund av flera steg (dvs. cellfärgning, cellfixering, membranbristning och centrifugering), kan celler lätt gå förlorade under förfarandet. Således är det viktigt att samla in ett tillräckligt antal enteroids. Det är viktigt att kombinera 2−3 brunnar (i en 24 brunnsplatta) av enteroids före fixering. Slutligen är det viktigt att lägga till ingredienser i bufferten för att upptäcka EdU, annars kommer reaktionen inte att fortsätta optimalt.
Sammanfattningsvis detaljerprotokollet steg för odling av mus enteroids in vitro och kvantifiering av föröka och döda celler genom flöde cytometri. Enteroids är användbara verktyg för sjukdommodellering och terapeutisk läkemedelsupptäckt. Detta protokoll hjälper utforskning av effekterna av inflammatoriska cytokiner, patogener och läkemedel på cellproliferation och cellöverlevnad i enteroid kulturmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 och 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Forskningsfonden för statens nyckellaboratorium för farmaceutisk bioteknik, Nanjing universitetar (KF-GN-202004). Natural Science Foundation av Jiangsu högskolor i Kina (19KJB320003), Livelihood and Technology Program i Suzhou City (SYS2019030), och Research Innovation Program för högskoleexamen i Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Detta arbete stöds också av Tang Scholar vid Soochow University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
