फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स से कैस्टेशन-प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से छोटे गैर-कोडिंग आरएनए को अनुक्रमित करना
Summary
चिकित्सा प्रतिरोध अक्सर उन्नत प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में विकसित होता है, और कुछ मामलों में, कैंसर न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर नामक घातक उपप्रकार की प्रगति करता है। छोटे गैर कोडिंग आरएनए मध्यस्थता आणविक परिवर्तन है कि इस संक्रमण की सुविधा का आकलन बेहतर रोग स्तरीकरण और कारण तंत्र है कि न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर के विकास के लिए नेतृत्व की पहचान की अनुमति होगी ।
Abstract
एंड्रोजन रिसेप्टर (एआर) का एब्लेशन एंड्रोजन अभाव द्वारा संकेत देना प्रोस्टेट कैंसर के लिए चिकित्सा की पहली पंक्ति का लक्ष्य है जिसके परिणामस्वरूप शुरू में कैंसर प्रतिगमन होता है। हालांकि, मामलों की एक महत्वपूर्ण संख्या में, रोग उन्नत, बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर (सीआरपीसी) की प्रगति करता है, जिसमें सीमित चिकित्सीय विकल्प होते हैं और अक्सर आक्रामक होते हैं। दूर मेटाटैसिस ज्यादातर आक्रामक बीमारी के इस चरण में मनाया जाता है। सीआरपीसी का इलाज एआर पाथवे अवरोधकों की दूसरी पीढ़ी द्वारा किया जाता है जो शुरू में अस्तित्व में सुधार करते हैं, जिसके बाद चिकित्सा प्रतिरोध के उद्भव होते हैं। न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर (एनईपीसी) प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) का एक दुर्लभ संस्करण है जो अक्सर न्यूरोएंडोक्राइन भेदभाव (एनईडी) के रूप में जानी जाने वाली ट्रांसविडेशन प्रक्रिया के माध्यम से चिकित्सा प्रतिरोध के परिणामस्वरूप विकसित होता है, जिसमें पीसीए कोशिकाएं वंश स्विच से गुजरती हैं एडेनोकार्सिनोमा से और न्यूरोएंडोक्राइन (एनई) वंश मार्कर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाते हैं। जीनोमिक परिवर्तन के अलावा जो एनईपीसी के लिए प्रगति और पारदर्शिया को ड्राइव करते हैं, एपिजेनेटिक कारकों और माइक्रोएनवायरमेंटल संकेतों को ड्राइविंग रोग प्रगति में आवश्यक खिलाड़ी माना जाता है। यह पांडुलिपि एपिजेनेटिक ड्राइवरों (यानी छोटे गैर-कोडिंग आरएनए) की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो उन्नत पीसीए से जुड़े हुए हैं। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) मेटास्टैटिक ऊतकों और इसी सीरम-व्युत्पन्न एक्स्सेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) से शुद्ध माइक्रोआरएनए का उपयोग करना, प्रोटोकॉल अनुक्रमण के लिए उचित गुणवत्ता नियंत्रण के साथ पुस्तकालयों को तैयार करने का वर्णन करता है इन नमूना स्रोतों से माइक्रोआरएनए। एफएफपीई और ईवीएस दोनों से आरएनए को अलग करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि इसमें से अधिकांश या तो अपमानित होते हैं या मात्रा में सीमित होते हैं। यह प्रोटोकॉल अनुक्रमण पर सबसे विशिष्ट पढ़ता है और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उपज करने के लिए आरएनए इनपुट और सीडीएनए पुस्तकालयों को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न तरीकों के बारे में विस्तार से बताया जाएगा।
Introduction
प्रोस्टेट कैंसर एआर सिग्नलिंग के माध्यम से अभिनय एंड्रोजन द्वारा संचालित है। इसलिए, एआर पाथवे को लक्षित करना बीमारी1के लिए मुख्य आधार उपचार है। हालांकि, प्रतिरोध अक्सर लक्षित उपचारों के परिणामस्वरूप होता है और रोग एक उन्नत मेटास्टैटिक सीआरपीसी2की प्रगति करता है। सीआरपीसी का इलाज एआर थेरेपी की दूसरी पीढ़ी द्वारा किया जाता है जिसमें एंजालुटाइड और एबिरेटेरोन2,3 शामिल हैं जो शुरू में अस्तित्व में सुधार करते हैं। हालांकि, एनईपीसी जैसे घातक वेरिएंट अक्सर इलाज सीआरपीसी के 25−30% मामलों में उभरते हैं जिनके पास सीमित उपचार विकल्प होते हैं, जिससे मृत्यु दर3में वृद्धि होती है। एनईपीसी नेड के नाम से जानी जाने वाली एक रिवर्सेबल ट्रांसपेर्युशंस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न होती है, जिसमें पीसीए कोशिकाएं एडेनोकार्सिनोमा से वंश स्विच से गुजरती हैं और एनोलेस 2 (ENO2), क्रोमोग्रेन ए (CHGA) और सिनैप्टोफिजिसिन (SYP)4सहित एनई वंश मार्कर की एआर और बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। यह देखते हुए कि ये प्रतिरोध वेरिएंट चिकित्सीय हस्तक्षेपों के परिणामस्वरूप उत्पन्न होते हैं, उन रास्तों को समझना आवश्यक है जो इस घातक की पीढ़ी को जन्म देते हैं, पीकेए के रूप का इलाज करना मुश्किल है।
एनईपीसी के जीनोमिक्स को हाल ही में बेल्ट्रान एट अल द्वारा किए गए एक संपूर्ण अध्ययन में समझा गया था जिससे कॉपी संख्या परिवर्तन, उत्परिवर्तन, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs), और रोगी से डीएनए मिथाइलेशन-व्युत्पन्न मेटास्टैटिक ऊतकों का विश्लेषण किया गया था। पीसीए के इस आक्रामक रूप के जीनोमिक्स की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, छोटे गैर-कोडिंग आरएनए (माइक्रोआरएनए) सहित एपिजेनेटिक कारकों के बारे में बहुत कम जाना जाता है जो सीआरपीसी-एडेनोकार्सिनोमा से एनईपीसी के संक्रमण में शामिल हैं। माइक्रोआरएनए (miRNAs) 22 बीपी लंबे, डबल-फंसे RNAs हैं जो मुख्य रूप से जीन अभिव्यक्ति को दबाने के बाद-अनुक्रम-विशिष्ट बातचीत द्वारा अनुक्रम-विशिष्ट बातचीत द्वारा कार्य करते हैं, कॉग्नेट एमआरएनए लक्ष्य6के साथ विशिष्ट बातचीत। कई ऑनकोमियर्स और ट्यूमर दबाने वालों की पहचान अब की गई है, और रोग की शुरुआत और मेटाटैसिस को विनियमित करने में उनकी भूमिका का विभिन्न कैंसर6,7में अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है । ये छोटे गैर – कोडिंग आरएनए अक्सर रोग मृत्यु दर6,8,9को नियंत्रित करने में बहुत महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में काम करते हैं । हाल ही में अनुसंधान ऐसे exosomes के रूप में EVs में अपने परिवहन के माध्यम से कैंसर मेटास्तासिस में miRNAs के पैराक्राइन प्रभावको समझने पर ध्यान केंद्रित किया गया है, कि खून में प्रवाह और ट्यूमर कोशिकाओं को एक nuclease मुक्त वातावरण10,11,12में मेटास्टैटिक स्थानों के लिए इन माध्यमिक दूतों भेजने के लिए अनुमति देते हैं । ईवीएस ट्यूमर कोशिकाओं से miRNAs ले मेजबान कोशिकाओं12से बदलने के प्रभाव को स्थानांतरित करने के लिए । इसलिए ट्यूमर कोशिकाओं के माध्यमिक दूतों के रूप में ईवीएस की पहचान रोग की गंभीरता का गैर-आक्रामक पता लगाने में उपयोगी हो सकती है।
एमआईआर-1246 आक्रामक पीसीए से ईवीएस में अत्यधिक अपरेज़ है, और यह रोग की गंभीरता13को इंगित करता है। ये ईवी-संबद्ध एमआईआरएनए न केवल बीमारी के नॉनइनवेसिव बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं, बल्कि ट्यूमरकोनेसिस चलाने में कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण भूमिकाएं भी निभाते हैं। इस प्रकार, नॉनइनवेसिव बायोमार्कर की बेहतर पहचान के साथ-साथ उनके कार्यात्मक महत्व की अनुमति देने के लिए पीकेए के प्रतिरोधी रूपों से जुड़े एमआईआरएनए प्रदर्शनों की सूची के महत्व को समझना आवश्यक है।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन ने ट्यूमर परिदृश्य के विवरण का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक मंच की पेशकश की है जिसमें जीनोम में परिवर्तन, गुणसूत्र पुनर्स्थान, क्रोमोथ्रिप्सिस और मिथाइलेशन शामिल हैं, जो सभी कैंसर14,15,16के रूप और प्रकृति में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं । इसी तरह, ट्यूमर कोशिका में होने वाले विशाल एपिनोमिक परिवर्तनों को समझने के लिए यह एक आवश्यक उपकरण भी है और जो अक्सर रोग गंभीरता17में महत्वपूर्ण खिलाड़ी होते हैं। एनईपीसी की पीढ़ी से जुड़े मिरना प्रदर्शनों की सूची को समझने के उद्देश्य से, एफएफपी मेटास्टैटिक सीआरपीसी ऊतकों और उनके इसी सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस पर छोटे आरएनए अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था। इन दो नमूना स्रोतों में से किसी से प्राप्त आरएनए (1) उपज में कम है और दुर्गति के कारण खराब गुणवत्ता का (2) है जो अक्सर फॉर्मेलिन निर्धारण और ईवी अलगाव के कारण होता है। इसके अलावा, सीडीएनए पुस्तकालयों का उत्पादन एक महत्वपूर्ण है, लेकिन बोझिल, एक अनुक्रमण रन का कदम है । इस प्रकार, इन RNAs को अलग करने और छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए उनका उपयोग करने के तरीकों को सटीक और विश्वसनीय डेटा उत्पन्न करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
आरटी-पीसीआर, माइक्रोरेज़, और इन-सीटू संकरण (ईश) सहित विभिन्न नमूनों में मिरना अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के कई तरीके हैं। आरटी-पीसीआर और ईश द्वारा मिरना अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एफएफपीई ऊतक-व्युत्पन्न आरएनए का उपयोग करने वाला एक प्रोटोकॉल हाल ही में18प्रकाशित किया गया था। हाल की प्रौद्योगिकियां एक नमूने में मिरना अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए अधिक संपूर्ण और व्यापक प्लेटफार्म प्रदान करती हैं। नैनोस्ट्रिंग nCounter एक संवेदनशील मिरना डिटेक्शन प्लेटफॉर्म19प्रदान करता है, लेकिन पता लगाने अक्सर मिरना की संख्या से सीमित होता है जो सरणी (~ 2,000) में उपलब्ध हैं। ऐसे परिदृश्य में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण जैसे अधिक संवेदनशील और संपूर्ण मंच20विभिन्न नमूनों में मिरना पहचान और एक साथ प्रोफाइलिंग की अधिक व्यापक गहराई प्रदान करता है। इस विधि का उपयोग पीसीए रोगियों21,22,23से मूत्र या प्लाज्मा में मिरना हस्ताक्षर निर्धारित करने के लिए किया गया है । वर्तमान लेख में, एफएफपीई ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवी आरएनए का उपयोग करके आक्रामक सीआरपीसी से जुड़े मिरना प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, हम एफएफपीई ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न ईवीएस से आरएनए को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो किट का उपयोग करके अनुकूलित किए गए थे जो अलग-थलग आरएनए की उपज और गुणवत्ता को बढ़ाने के लि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान अधिग्रहण गतिविधि (USAMRAA) द्वारा विचार विकास पुरस्कार अंडरअवार्ड नंबर के माध्यम से समर्थित किया जाता है । W81XWH-18-1-303 और W81XWH-18-2-0013 और अतिरिक्त पुरस्कार संख्या द्वारा । W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, और W81XWH-18-2-0019 प्रोस्टेट कैंसर Biorepository नेटवर्क (PCBN) । राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान संख्या RO1CA177984) में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा लेखकों की प्रयोगशाला के लिए धन सहायता भी स्वीकार किया है । राजवीर दहिया दिग्गजों मामलों के विभाग, BX004473 में एक वरिष्ठ अनुसंधान कैरियर वैज्ञानिक है और NIH-UO1CA199694 (RD) द्वारा वित्त पोषित । राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष, और सिफारिशों लेखक के उन रहे है और जरूरी रक्षा विभाग या अमेरिकी सेना द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । हम नेक्स्टसेक्यू 500 सीक्वेंसर के साथ उनकी सहायता के लिए सैन फ्रांसिस्को वीएएमसी में कोर सुविधा के निदेशक जूडी शिगेनागा के आभारी हैं।
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
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