Séquençage de petits ARN non codants à partir de tissus fixeds et d'exosomes dérivés du sérum provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration
Summary
La résistance de thérapie se développe souvent dans les patients présentant le cancer de la prostate avancé, et dans certains cas, le cancer progresse à un sous-type mortel appelé cancer de la prostate neuroendocrine. L’évaluation des petits changements moléculaires non codants à médiation d’ARN qui facilitent cette transition permettrait une meilleure stratification de la maladie et l’identification des mécanismes causals qui mènent au développement du cancer de la prostate neuroendocrine.
Abstract
L’ablation du récepteur d’androgène (AR) signalant par la privation d’androgène est l’objectif de la première ligne de thérapie pour le cancer de la prostate qui a d’abord comme conséquence la régression de cancer. Cependant, dans un nombre significatif de cas, la maladie progresse au cancer de la prostate avancé et résistant à la castration (CRPC), qui a des options thérapeutiques limitées et est souvent agressif. La métastes lointaine est la plupart du temps observée à ce stade de la maladie agressive. Le CRPC est traité par une deuxième génération d’inhibiteurs de voie d’AR qui améliorent la survie au commencement, suivis par l’émergence de la résistance de thérapie. Le cancer neuroendocrinien de la prostate (NEPC) est une variante rare du cancer de la prostate (PCa) qui se développe souvent en raison de la résistance de thérapie par l’intermédiaire d’un processus de transdifférenciation connu sous le nom de différenciation neuroendocrine (NED), où les cellules de PCa subissent un commutateur de lignée des adénocarcinomes et montrent l’expression accrue des marqueurs de lignée neuroendocrine (NE). En plus des altérations génomiques qui conduisent la progression et la transdifférenciation au NEPC, les facteurs épigénétiques et les indices microenvironnementaux sont considérés comme des acteurs essentiels dans la progression de la maladie. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour identifier les facteurs épigénétiques (c.-à-d. les petits ARN non codants) qui sont associés à la PCa avancée. À l’aide de microARN purifiés provenant de tissus métastatiques paraffinés à base de paraffines (FFPE) et de vésicules extracellulaires (VEV) dérivées du sérum correspondant, le protocole décrit comment préparer les bibliothèques à un contrôle de qualité approprié pour le séquençage microARN provenant de ces sources d’échantillons. L’isolat de l’ARN de la FFPE et des véhicules électriques est souvent difficile parce que la plupart de celui-ci est soit dégradé ou est limité en quantité. Ce protocole élaborera sur différentes méthodes pour optimiser les entrées d’ARN et les bibliothèques d’ADNc pour produire la plupart des lectures spécifiques et des données de haute qualité au niveau du séquençage.
Introduction
Le cancer de la prostate est entraîné par des androgènes agissant par l’intermédiaire de la signalisation AR. Par conséquent, le ciblage de la voie AR est le traitement principal de la maladie1. Cependant, la résistance s’ensuit souvent à la suite de thérapies ciblées et la maladie progresse à un CRPC métastatique avancé2. CRPC est traité par la deuxième génération de thérapie d’AR qui inclut l’enzalutamide et l’abiraterone2,3 qui améliore la survie au commencement. Cependant, des variantes mortelles telles que NEPC émergent souvent dans 25-30% des cas traités de CRPC qui ont des options limitées de traitement, menant à la mortalité accrue3. NEPC se pose par un processus de transdifférenciation réversible connu sous le nom de NED, dans lequel les cellules PCa subissent un commutateur de lignée de l’adénocarcinome et montrent une diminution de l’expression de l’AR et l’expression accrue des marqueurs de lignée NE, y compris l’enolase 2 (ENO2), la chromoscine A (CHGA), et la synaptophyse (SYP)4. Étant donné que ces variantes de résistance résultent d’interventions thérapeutiques, il est essentiel de déchiffrer les voies qui mènent à la génération de cette forme mortelle et difficile à traiter de PCa.
La génomique de NEPC a été récemment déchiffrée dans une étude exhaustive faite par Beltran et autres par laquelle des altérations de nombre de copie, des mutations, des polymorphismes de nucléotide simples (SNPs), et la méthylation d’ADN des tissus métastatiques patient-dérivés ont été analysés5. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension de la génomique de cette forme agressive de PCa, on sait peu de choses sur les facteurs épigénétiques, y compris les petits ARN non codants (microARN) qui sont impliqués dans la transition de CRPC-adénocarcinome à NEPC. Les microARN (miARN) sont 22 bp de long, double brin RNAs qui agissent principalement en supprimant l’expression des gènes post-transcriptionnellepar par des interactions séquence-spécifiques avec les régions 3′-non traduits (UTR) des cibles d’ARNm cognate6. Plusieurs oncomiRs et suppresseurs de tumeur ont maintenant été identifiés, et leur rôle dans la régulation de l’début de la maladie et la métastasie a été bien étudié dans différents cancers6,7. Ces petits ARN non codants servent souvent de cibles très importantes dans le contrôle de la mortalité par maladie6,8,9. Des recherches plus récentes ont porté sur la compréhension des effets paracrines des miARN dans la métastase du cancer par le biais de leur transport dans les véhicules électriques, tels que les exosomes, qui circulent dans la circulation sanguine et permettent aux cellules tumorales d’envoyer ces messagers secondaires à des endroits métastatiques dans un environnement sans nucléane10,11,12. Les véhicules électriques transportent des miARN des cellules tumorales pour transférer les effets transformateurs des cellules hôtes12. L’identification des véhicules électriques en tant que messagers secondaires des cellules tumorales peut donc être utile dans la détection non invasive de la gravité de la maladie.
Le miR-1246 est fortement reréglementé dans les véhicules électriques de PCa agressif, et il indique la gravité de la maladie13. Ces miARN EV-associés servent non seulement de biomarqueurs non invasifs de la maladie, mais jouent également des rôles fonctionnelment importants en conduisant la tumorigenesis. Ainsi, il est essentiel de comprendre la signification du répertoire miRNA qui est associé à des formes résistantes de PCa pour permettre une meilleure identification des biomarqueurs non invasifs ainsi que leur signification fonctionnelle.
L’avènement du séquençage de nouvelle génération a offert la plate-forme la plus complète pour étudier les détails du paysage tumoral impliquant des altérations dans le génome telles que des mutations, des relocalisations chromosomiques, la chromothripsis, et la méthylation, qui contribuent tous de manière significative à la forme et la nature du cancer14,15,16. De même, il est également un outil essentiel pour comprendre les vastes changements épigénomiques qui se produisent dans une cellule tumorale et qui sont souvent des acteurs importants dans la gravité de la maladie17. Dans le but de comprendre le répertoire de miRNA associé à la génération de NEPC, le petit séquençage d’ARN a été exécuté sur les tissus métastatiques de CRPC de FFPE et leurs VÉHICULES sériques correspondants. L’ARN dérivé de l’une ou l’autre de ces deux sources d’échantillon est (1) faible en rendement et (2) de mauvaise qualité en raison de la dégradation qui se produit souvent en raison de la fixation de formaline et de l’isolement de EV. En outre, la génération de bibliothèques d’ADNc est une étape critique, mais lourde, d’une course de séquençage. Ainsi, les méthodes d’isoler ces ARN et de les utiliser pour générer des bibliothèques pour le séquençage de l’ARN de petite taille nécessitent une optimisation pour générer des données précises et fiables.
Il existe plusieurs méthodes pour profiler l’expression miRNA dans différents échantillons, y compris RT-PCR, microarrays, et l’hybridation in situ (ISH). Un protocole utilisant l’ARN tissulaire FFPE pour évaluer l’expression de miRNA par RT-PCR et ISH a été récemment édité18. Les technologies plus récentes offrent des plates-formes plus exhaustives et plus complètes pour le profilage de l’expression des miARN dans un échantillon. NanoString nCounter offre une plate-forme de détection miRNA sensible19, mais la détection est souvent limitée par le nombre de miARN qui sont disponibles dans le tableau (2 000 euros). Dans un tel scénario, une plate-forme plus sensible et exhaustive telle que le séquençage de prochaine génération offre une profondeur beaucoup plus large d’identification miRNA et de profilage simultané dans différents échantillons20. La méthode a été utilisée pour déterminer les signatures miRNA dans l’urine ou le plasma des patients PCa21,22,23. Dans l’article actuel, un protocole est présenté pour utiliser une plate-forme de séquençage de prochaine génération pour étudier les profils de miRNA associés à crPC agressif utilisant des tissus FFPE et des ARN EV dérivés du sérum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler l’ARN des tissus ffPE et des véhicules électriques dérivés du sérum utilisant des kits qui ont été optimisés pour augmenter le rendement et la qualité des ARN isolés. En outre, les ARN purifiés ont été utilisés pour générer des bibliothèques d’ADNc pour le séquençage de l’ARN. Les deux étapes énumérées sont essentielles pour déterminer la qualité et la profondeur des lectures de séquençage qui sont le résultat final de la course<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par l’US Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA) par le biais de l’Idea Development Award underAward No. W81XWH-18-1-303 et W81XWH-18-2-0013 et en outre par Award no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, et W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Le soutien financier au laboratoire d’auteurs par l’Institut national du cancer des National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984) est également reconnu. Rajvir Dahiya est chercheur scientifique principal au ministère des Anciens Combattants, BX004473 et financé par NIH-UO1CA199694 (RD). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense ou l’armée américaine. Nous sommes reconnaissants à Judy Shigenaga, directrice de l’installation de base à San Francisco VAMC, pour son aide avec le séquenceur NextSeq 500.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
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