التسلسل الصغيرة غير الترميز RNA من Formalin-الانسجه الثابتة ومصل المشتقات Exosomes من المرضي سرطان البروستاتا المقاوم
Summary
غالبا ما تتطور المقاومة العلاج في المرضي الذين يعانون من سرطان البروستاتا المتقدمة ، وفي بعض الحالات ، يتطور السرطان إلى نوع فرعي قاتل يسمي سرطان البروستاتا الغدد الصماء العصبية. ومن شان تقييم التغييرات الجزيئية الصغيرة غير الترميز بوساطة الجيش النيبالي التي تسهل هذا التحول ان يسمح بتحسين التقسيم الطبقي للامراض وتحديد أليات السببية التي تؤدي إلى تطوير سرطان البروستاتا العصبي الهرموني.
Abstract
الاجتثاث من مستقبلات الاندروجين (AR) إشارات الحرمان من الاندروجين هو الهدف من الخط الأول من العلاج لسرطان البروستاتا الذي يؤدي في البداية إلى انحدار السرطان. ومع ذلك ، في عدد كبير من الحالات ، يتطور المرض إلى سرطان البروستاتا المتقدمة ، التي تقاوم التطهير (CRPC) ، والتي لديها خيارات علاجيه محدوده وغالبا ما تكون عدوانيه. ويلاحظ في الغالب الانبثاث البعيد في هذه المرحلة من المرض العدواني. يتم التعامل مع CRPC من قبل الجيل الثاني من مثبطات المسار AR التي تحسن البقاء علي قيد الحياة في البداية ، تليها ظهور المقاومة العلاج. سرطان البروستاتا العصبية (NEPC) هو البديل نادره من سرطان البروستاتا (PCa) التي غالبا ما تتطور نتيجة للمقاومة العلاج عن طريق عمليه التمايز المعروفة باسم التمايز الغدد الصماء (نيد) ، حيث الخلايا PCa الخضوع للتبديل النسب من سرطانات الغدد وإظهار زيادة التعبير عن علامات النسب الغدد الصماء العصبية (NE). بالاضافه إلى التعديلات الجينية التي تدفع التقدم والتمايز إلى NEPC ، وتعتبر العوامل الوراثية والعظة البيئية الصغيرة اللاعبين الأساسيين في القيادة تطور المرض. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا للتعرف علي المحركات الوراثية (اي RNAs الصغيرة غير الترميز) المرتبطة ب الانيسول الخماسي الكلور المتقدم. باستخدام تنقيه ميكرورناس من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المنتشرة (FFPE) والمقابلة المستمدة من المصل الحويصلات خارج الخلية (المركبات أليفه) ، يصف البروتوكول كيفيه اعداد المكتبات مع مراقبه الجودة المناسبة للتسلسل ميكرورناس من هذه المصادر عينه. عزل الجيش النيبالي الريبي من كل من FFPE والمركبات التي غالبا ما تكون صعبه لان معظمها اما المتدهورة أو محدوده في الكمية. سيتوسع هذا البروتوكول في أساليب مختلفه لتحسين مدخلات الحمض الريبي النيبالي ومكتبات cDNA لإنتاج القراءات الأكثر تحديدا والبيانات عاليه الجودة عند التسلسل.
Introduction
ويقود سرطان البروستاتا الاندروجين التي تعمل عن طريق الإشارات AR. ولذلك ، فان استهداف مسار AR هو العلاج الدعامةالاوليللمرض 1. ومع ذلك ، غالبا ما تستتبع المقاومة نتيجة للعلاجات المستهدفة ويتطور المرض إلى CRPC2المتقدمة المنتشرة. يتم التعامل مع crpc من قبل الجيل الثاني من العلاج AR الذي يتضمن enzalutamide و abiraterone2,3 مما يحسن البقاء علي قيد الحياة في البداية. ومع ذلك ، غالبا ما تظهر المتغيرات المميتة مثل NEPC في 25 − 30 ٪ من حالات CRPC المعالجة التي لديها خيارات العلاج المحدودة ، مما يؤدي إلى زيادة الوفاات3. ينشا nepc عن طريق عمليه التمايز عكسها المعروفة باسم نيد ، حيث الخلايا PCa الخضوع للتبديل النسب من الأورام اللحمية وإظهار انخفاض التعبير عن AR وزيادة التعبير عن علامات النسب NE بما في ذلك اينولاز 2 (ENO2) ، كروموغرانين a (chga) ، و سينابتوفيسين (SYP)4. النظر إلى ان هذه المتغيرات المقاومة تنشا نتيجة للتدخلات العلاجية ، فمن الضروري لفك المسارات التي تؤدي إلى توليد هذا القاتل ، من الصعب معالجه شكل من الانيسول الخماسي الكلور.
وقد فك رموز مؤخرا علم الجينوم من NEPC في دراسة شامله التي قام بها Beltran et al. حيث نسخ التعديلات الرقم ، والطفرات ، وتعدد الاشكال النيوكليوتيد واحد (SNPs) ، وتحليل الحمض النووي من الانسجه المنتشرة المستمدة من المريض وحللت5. علي الرغم من التقدم الكبير في فهم علم الجينوم من هذا الشكل العدواني من الانيسول الخماسي الكلور ، لا يعرف سوي القليل عن العوامل الوراثية ، بما في ذلك الصغيرة غير الترميز RNAs (ميكرورناس) التي تشارك في الانتقال من CRPC-adenسرطاني إلى NEPC. ميكرورناس (miRNAs) هي 22 bp طويلة ، التي تقطعت بها السبل المزدوجة RNAs التي تعمل في المقام الأول عن طريق قمع التعبير الجيني ما بعد الهيستونات عن طريق التفاعلات تسلسل محدده مع 3 ‘-المناطق غير المترجمة (UTRs) من الهدفين mRNA الأهداف6. وقد تم الآن تحديد العديد من oncomirs والمثبطات الأورام ، ودورها في تنظيم بداية المرض والانبثاثوقد درست بشكل جيد في مختلف أنواعالسرطان 6 ،7. هذه rnas الصغيرة غير الترميز غالبا ما تكون أهدافا هامه جدافي السيطرة علي الوفااتالمرض 6 ،8،9. وقد تركزت البحوث الحديثة أكثر علي فهم الآثار paracrine من miRNAs في الانبثاث السرطان عن طريق نقلها في المركبات الخاصة, مثل exosomes, ان تتدفق في مجري الدم والسماح للخلايا السرطانية لإرسال هذه الرسل الثانوية إلى مواقع المنتشر في بيئة خاليه من النيوداز10,11,12. المركبات التي تحمل miRNAs من الخلايا السرطانية لنقل اثار تحويل من الخلايا المضيفة12. يمكن تحديد المركبات التي الناقلات الثانوية من الخلايا السرطانية التالي تكون مفيده في الكشف عن خطورة المرض غير الغازية.
مير-1246 هو اوبريجولاتيد للغاية في المركبات الخاصة من PCa العدوانية ، ويشير إلى خطورة المرض13. هذه miRNAs المرتبطة EV ليس فقط بمثابه المؤشرات الحيوية غير الغازية للمرض ، ولكن أيضا لعب ادوار مهمة وظيفيا في القيادة tumorigenesis. التالي ، فانه من الضروري فهم اهميه ذخيرة ميرنا التي ترتبط باشكال مقاومه من الانيسول الخماسي الكلور للسماح بتحديد أفضل لمؤشرات الحيوية غير الغازية فضلا عن أهميتها الوظيفية.
وقد قدم ظهور تسلسل الجيل القادم المنصة الأكثر شمولا لدراسة تفاصيل الورم المناظر الطبيعية التي تنطوي علي تعديلات في الجينوم مثل الطفرات ، ونقل الكروموسومات ، chromothripsis ، وميثيل ، وكلها تسهم إلى حد كبير في شكل وطبيعة السرطان14،15،16. المثل ، بل هو أيضا أداه أساسيه لفهم التغيرات الجينية الواسعة التي تحدث في خليه الورم والتي غالبا ما تكون اللاعبين المهمين في شده المرض17. بهدف فهم ذخيرة ميرنا المرتبطة بجيل NEPC ، تم تنفيذ تسلسل الحمض الريبي النيبالي الصغيرة علي الانسجه CRPC المنتشرة FFPE والمركبات الخاصة المقابلة المصل المشتقة. [رنا] يستنتج من اي من هذا اثنان عينه مصادر (1) منخفضه في غله و (2) من نوعيه سيئه واجبه إلى الانحلال ان غالبا يحدث واجبه إلى [فورالين] تثبيت و [ف] عزل. وعلاوة علي ذلك ، إنشاء مكتبات cDNA هو خطوه حرجه ، ولكنها مرهقه ، من تسلسل التشغيل. وهكذا ، أساليب لعزل هذه RNAs واستخدامها لإنشاء مكتبات لتسلسل الحمض الريبي النيبالي الصغيرة تتطلب الأمثل لتوليد بيانات دقيقه وموثوقه.
هناك عده طرق لتعريف التعبير ميرنا في عينات مختلفه ، بما في ذلك RT-PCR ، ميكروصفائف ، والتهجين في الموقع (ISH). وقد نشر مؤخرا بروتوكول باستخدام الحمض الريبي الليفي المشتق من الانسجه FFPE لتقييم التعبير ميرنا من قبل RT-PCR و ISH18. أكثر التكنولوجيات الحديثة تقدم منصات أكثر شمولا وشامله لتنميط التعبير ميرنا في عينه. نانوسترينج nCounter يقدم منصة الكشف عن ميرنا الحساسة19، ولكن غالبا ما يقتصر الكشف عن طريق عدد mirnas التي تتوفر في الصفيف (~ 2,000). وفي مثل هذا السيناريو ، توفر منصة أكثر حساسية وشمولا مثل تسلسل الجيل التالي عمقا أوسع بكثير من تعريف ميرنا والتنميط المتزامن في عينات مختلفه20. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد التواقيع ميرنا في البول أو البلازما من المرضي PCa21,22,23. في المقالة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لاستخدام منصة تسلسل الجيل القادم لدراسة ملامح ميرنا المرتبطة CRPC العدوانية باستخدام الانسجه FFPE والمستمدة من المصل EV RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، ونحن وصف بروتوكول لعزل الحمض الريبي النيبالي من الانسجه FFPE والمركبات التي تستمد المصل باستخدام مجموعات التي تم تحسينها لزيادة الغلة وجوده RNAs معزولة. علاوة علي ذلك ، تم استخدام RNAs المنقي لإنشاء مكتبات cDNA لتسلسل RNA الصغير. كل من الخطوات المذكورة ضرورية في تحديد جوده وعمق الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل الجيش الأمريكي البحوث الطبية نشاط الاستحواذ (USAMRÅ) من خلال جائزه التنمية فكره الجائزة السفلي لا. W81XWH-18-1-303 و W81XWH-18-2-0013 الاضافه إلى ذلك عن طريق الجائزة لا. W81XWH-18-2-0015 ، W81XWH-18-2-0016 ، W81XWH-18-2-0017 ، W81XWH-18-2-0018 ، و W81XWH-18-2-0019 شبكه المستودع البيولوجي لسرطان البروستاتا (PCBN). ويعترف أيضا بالدعم التمويلي لمختبر المؤلفين الذي يقدمه المعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم RO1CA177984). راجفير داهيا هي عالمه أبحاث مهنية أقدم في قسم شؤون المحاربين القدماء ، BX004473 وتمول من UO1CA199694 (RD). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك الخاصة بالمؤلف ولا تحظي بالضرورة بتاييد وزاره الدفاع أو الجيش الأمريكي. ونحن ممتنون لجودي Shigenaga ، مدير المرافق الاساسيه في سان فرانسيسكو VAMC ، لمساعدتها مع التسلسل التالي 500 المتسلسلة.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
