Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten
Summary
Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.
Abstract
Ablatie van androgeen receptor (AR) signalering door androgeen deprivatie is het doel van de eerste lijn van de therapie voor prostaatkanker die in eerste instantie resulteert in kanker regressie. In een groot aantal gevallen vordert de ziekte echter tot gevorderde, castratie bestendige prostaatkanker (CRPC), die beperkte therapeutische opties heeft en vaak agressief is. Verre metastase wordt meestal waargenomen in dit stadium van de agressieve ziekte. CRPC wordt behandeld door een tweede generatie van AR-pathway-remmers die de overleving in eerste instantie verbeteren, gevolgd door de opkomst van de therapie resistentie. Neuro-endocriene prostaatkanker (NEPC) is een zeldzame variant van prostaatkanker (PCa) die zich vaak ontwikkelt als gevolg van resistentie tegen de therapie via een trans differentiatieproces bekend als neuro-endocriene differentiatie (NED), waarbij PCa-cellen een lineage-schakelaar ondergaan van adenocarcinomen en Toon verhoogde expressie van neuro-endocriene (NE) Lineage markers. Naast de genomische veranderingen die de progressie en de trans differentiatie naar NEPC stimuleren, worden epigenetische factoren en microenvironmental cues beschouwd als essentiële spelers in het stimuleren van ziekteprogressie. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol om de epigenetische bestuurders (d.w.z. kleine niet-Codeer Rna’s) te identificeren die geassocieerd zijn met Advanced PCa. Met behulp van gezuiverde Microrna’s van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) gemetastaseerde weefsels en overeenkomstige uit serum afgeleide extracellulaire blaasjes (Ev’s), wordt in het protocol beschreven hoe u bibliotheken voorbereidt met de juiste kwaliteitscontrole voor sequentiëren Microrna’s uit deze voorbeeld bronnen. Het isoleren van RNA van zowel FFPE als EVs is vaak een uitdaging omdat de meeste ervan is aangetast of beperkt in kwantiteit. Dit protocol zal uitwerken op verschillende methoden om de RNA-ingangen en cDNA-bibliotheken te optimaliseren om de meest specifieke leesbewerkingen en gegevens van hoge kwaliteit te leveren bij sequencing.
Introduction
Prostaatkanker wordt gedreven door androgenen die handelen via AR-signalering. Daarom is het targeten van de AR-route de Mainstay-behandeling voor de ziekte1. Echter, resistentie vaak ontstaat als gevolg van gerichte therapieën en de ziekte vordert naar een gevorderd gemetastaseerd CRPC2. Crpc wordt behandeld door een tweede generatie AR-therapie met enzalutamide en abirateron2,3 die de overleving in eerste instantie verbetert. Dodelijke varianten zoals NEPC komen echter vaak voor in 25 − 30% van de behandelde CRPC-gevallen met beperkte behandelingsopties, wat leidt tot verhoogde sterfte3. NEPC ontstaat via een omkeerbaar trans differentiatieproces dat bekend staat als NED, waarin PCa-cellen een lineage-overschakeling ondergaan van adenocarcinomen en een verminderde expressie van AR vertonen en een verhoogde expressie van NE-Lineage markers, waaronder Enolase 2 (ENO2), chromogranine A (CHGA) en synaptophysin (SYP)4. Gezien het feit dat deze resistentie varianten ontstaan als gevolg van therapeutische interventies, is het essentieel om trajecten te ontcijferen die leiden tot het genereren van deze dodelijke, moeilijk te behandelen vorm van PCa.
De genomica van NEPC werd onlangs ontcijferd in een uitputtende studie uitgevoerd door Beltran et al. waarbij het aantal wijzigingen in het afschrift, mutaties, enkelvoudige nucleotide polymorfismen (Snp’s) en DNA-methylatie van door patiënten afgeleide metastatische weefsels werden geanalyseerd5. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de Genomics van deze agressieve vorm van PCa, is er weinig bekend over de epigenetische factoren, waaronder de kleine niet-Codeer Rna’s (Microrna’s) die betrokken zijn bij de overgang van CRPC-adenocarcinoom naar NEPC. MicroRNAs (miRNAs) zijn 22 BP lange, dubbel gestrande rna’s die primair handelen door het onderdrukken van genexpressie post-transcriptioneel door sequentie-specifieke interacties met de 3 ‘-onververtaalde gebieden (utrs) van verwant mRNA targets6. Verschillende oncomirs en tumor suppressors zijn nu geïdentificeerd, en hun rol bij het reguleren van de ziekte aanvang en metastase is goed bestudeerd in verschillende kankers6,7. Deze kleine niet-Codeer rna’s dienen vaak als zeer belangrijke doelen bij het beheersen van ziekte sterfte6,8,9. Meer recent onderzoek is gericht op het begrijpen van de paracrine effecten van miRNAs in kanker metastasen via hun transport in EVs, zoals exosomen, die stroom in de bloedbaan en laat tumorcellen om deze secundaire boodschappers naar gemetastaseerde locaties in een Nuclease-vrije omgeving te sturen10,11,12. EVs dragen miRNAs uit de tumorcellen om de transformerende effecten van de hostcellen12over te brengen. Identificatie van EVs als secundaire boodschappers van tumorcellen kan daarom nuttig zijn bij niet-invasieve opsporing van de ernst van de ziekte.
De miR-1246 is sterk upregulated in EVs van agressieve PCa, en het geeft de ziekte ernst13. Deze EV-geassocieerde miRNAs dient niet alleen als niet-invasieve biomarkers van de ziekte, maar speelt ook functioneel belangrijke rollen in het rijden van tumorigenesis. Het is dus essentieel om de betekenis te begrijpen van het miRNA-repertoire dat is geassocieerd met resistente vormen van PCa, om een betere identificatie van niet-invasieve biomarkers en hun functionele betekenis mogelijk te maken.
De komst van de volgende generatie sequencing heeft het meest uitgebreide platform aangeboden om de details van het tumor landschap te bestuderen, waarbij veranderingen in het genoom worden aangebracht, zoals mutaties, chromosomale relocaties, chromothripsis en methylatie, die allemaal aanzienlijk bijdragen aan de vorm en de aard van kanker14,15,16. Evenzo is het ook een essentieel instrument om de enorme epigenomische veranderingen te begrijpen die in een tumor cel voorkomen en die vaak belangrijke spelers zijn in de ernst van de ziekte17. Met het oog op het begrijpen van het repertoire van miRNA dat geassocieerd is met de generatie van NEPC, werd kleine RNA-sequencing uitgevoerd op FFPE-gemetastaseerd CRPC-weefsel en hun corresponderende EVs met serum-afgeleide. RNA afkomstig van een van deze twee monsterbronnen is (1) laag in opbrengst en (2) van slechte kwaliteit als gevolg van de afbraak die vaak gebeurt als gevolg van formaline fixatie en EV-isolatie. Bovendien is het genereren van cDNA-bibliotheken een kritieke, maar omslachtige stap van een sequentiëren uitvoeren. Dus, methoden voor het isoleren van deze Rna’s en het gebruik ervan om bibliotheken te genereren voor kleine RNA-sequencing vereisen optimalisatie om accurate en betrouwbare gegevens te genereren.
Er zijn verschillende methoden voor het profiel van miRNA expressie in verschillende monsters, waaronder RT-PCR, micro arrays en in-situ hybridisatie (ISH). Een protocol met behulp van FFPE weefsel-afgeleide RNA te evalueren miRNA uitdrukking door RT-PCR en ISH werd onlangs gepubliceerd18. Meer recente technologieën bieden uitgebreidere en uitgebreidere platforms voor profilering van miRNA-expressie in een steekproef. Nano string nCounter biedt een gevoelig miRNA detectie platform19, maar de detectie wordt vaak beperkt door het aantal miRNAs dat beschikbaar is in de array (~ 2.000). In een dergelijk scenario biedt een gevoeliger en uitputtend platform, zoals de volgende generatie sequencing, een veel bredere diepte van miRNA-identificatie en gelijktijdige profilering in verschillende monsters20. De methode is gebruikt om de Mirna-handtekeningen in urine of plasma te bepalen bij PCA-patiënten21,22,23. In het huidige artikel wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van een volgende generatie sequencing-platform om miRNA-profielen te bestuderen die zijn gekoppeld aan agressieve CRPC met behulp van FFPE-weefsels en door serum afgeleide EV-Rna’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we een protocol om RNA te isoleren van FFPE-weefsels en door serum afgeleide Ev’s met behulp van kits die zijn geoptimaliseerd om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde Rna’s te verhogen. Verder werden de gezuiverde Rna’s gebruikt om cDNA-bibliotheken te genereren voor kleine RNA-sequencing. Beide van de vermelde stappen zijn essentieel voor het bepalen van de kwaliteit en de diepte van de sequentiëren leesbewerkingen die het eindresultaat van de run24zijn. Daarom i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de US Army Medical Research acquisitie activity (USAMRAA) via de IDEA Development Award under Award No. W81XWH-18-1-303 en W81XWH-18-2-0013 en bovendien door Awardnr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, en W81XWH-18-2-0019 prostaatkanker Biorepository netwerk (PCBN). Ook de financiering van steun aan auteurs laboratorium door het National Cancer Institute aan de National Institutes of Health (subsidie nummer RO1CA177984) wordt erkend. Rajvir Dahiya is een Senior Research Career Scientist bij de afdeling Veterans Affairs, BX004473 en gefinancierd door NIH-UO1CA199694 (RD). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie of het Amerikaanse leger. We zijn Judy Shigenaga, directeur van Core Facility in San Francisco VAMC, dankbaar voor haar hulp bij de NextSeq 500 sequencer.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
