Секвенирование малых некодирующих РНК от формина-фиксированных тканей и сыворотки полученных экзосом от кастрации устойчивых больных раком предстательной железы
Summary
Терапия сопротивление часто развивается у пациентов с прогрессирующим раком простаты, а в некоторых случаях, рак прогрессирует до смертельного подтипа называется нейроэндокринный рак предстательной железы. Оценка небольших некодирующих РНК-опосредованных молекулярных изменений, которые облегчают этот переход позволит лучше стратификации болезни и выявления причинных механизмов, которые приводят к развитию нейроэндокринного рака предстательной железы.
Abstract
Абляция рецепторов андрогенов (AR) сигнализации андрогенов лишения является целью первой линии терапии рака простаты, что первоначально приводит к регрессии рака. Однако, в значительном числе случаев, болезнь прогрессирует до передовых, кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC), который имеет ограниченные терапевтические возможности и часто агрессивно. Дистанционные метастазы в основном наблюдаются на этой стадии агрессивного заболевания. CRPC лечится вторым поколением ингибиторов AR пути, которые улучшают выживание на начальном этапе, а затем появление резистентности терапии. Нейроэндокринный рак предстательной железы (NEPC) является редким вариантом рака предстательной железы (PCa), который часто развивается в результате терапии устойчивость через процесс трансдифференцации, известный как нейроэндокринная дифференциация (NED), в котором PCa клетки проходят линию переключатель от аденокарциномы и показать повышенное выражение нейроэндокринной (NE) линии маркеров. В дополнение к геномным изменениям, которые управляют прогрессией и трансдифференциацией к NEPC, эпигенетические факторы и микроэкологические сигналы считаются важными игроками в продвижении болезни. Данная рукопись содержит подробный протокол для выявления эпигенетических драйверов (т.е. небольших некодирующих РНК), которые связаны с передовыми PCa. Использование очищенных микроРНК из формалина-фиксированного парафина-встроенных (FFPE) метастатических тканей и соответствующих сывороточных внеклеточных пузырьков (EVs), протокол описывает, как подготовить библиотеки с соответствующим контролем качества для секвенирования микроРНК из этих источников выборки. Изолировать РНК как от FFPE, так и от EVs часто является сложной задачей, поскольку большая ее часть либо деградирует, либо ограничена в количестве. В этом протоколе будут разработаны различные методы оптимизации входов РНК и библиотек кДНК для получения наиболее конкретных считываний и высококачественных данных при секвенировании.
Introduction
Рак предстательной железы обусловлен андрогенов, действующих через AR сигнализации. Таким образом, ориентация на путь AR является основой лечения болезни1. Тем не менее, сопротивление часто наступает в результате целенаправленной терапии и болезнь прогрессирует до передовых метастатических CRPC2. CRPC лечится вторым поколением AR терапии, которая включает в себя энзалутамид и абиратерон2, 3, который улучшает выживание на начальном этапе. Тем не менее, смертельные варианты, такие как NEPC часто возникают в 25-30% обработанных случаев CRPC, которые имеют ограниченные варианты лечения, что приводит к увеличению смертности3. NEPC возникает через обратимый процесс трансдифферециации, известный как NED, в котором pCa клетки проходят линию переключатель от аденокарциномы и показать снижение экспрессии AR и увеличение экспрессии NE маркеров линии, включая энолазу 2 (ENO2), хромогранин A (CHGA), и синаптофизин (SYP)4. Учитывая, что эти варианты сопротивления возникают в результате терапевтических вмешательств, важно расшифровать пути, которые приводят к генерации этого смертельного, трудно поддающееся лечению формы PCa.
Геномика NEPC была недавно расшифрована в исчерпывающем исследовании, проведенном Beltran et al., в котором былипроанализированыизменения числа копий, мутации, однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) и метилирование ДНК из метастатических тканей, полученных пациентом. Несмотря на значительное продвижение в понимании геномики этой агрессивной формы PCa, мало что известно об эпигенетических факторах, в том числе небольших некодирующих РНК (микроРНК), которые участвуют в переходе CRPC-аденокарциномы на NEPC. МикроРНК (miRNAs) 22 bp длиной, двуцейцы РНК, которые действуют в первую очередь путем подавления экспрессии генов после транскрипционно последовательности по последовательности конкретных взаимодействий с 3′-непереведенных регионов (UTRs) коньяк мРНК цели6. Несколько онкомиров и супрессоры опухоли в настоящее время определены, и их роль в регулировании начала заболевания и метастазирования был хорошо изучен в различных раковыхзаболеваний 6,7. Эти небольшие некодивные РНК часто служат очень важными целями в борьбе со смертностью от болезней6,8,9. Более поздние исследования были сосредоточены на понимании паракринных эффектов miRNAs в метастазы рака через их транспорт в EVs, таких как экзосомы, которые текут в крови и позволяют опухолевые клетки, чтобы отправить эти вторичные посланники метастатических местах в нуклеазной свободной среде10,11,12. EVs нести miRNAs из опухолевых клеток для передачи трансформирующих эффектов от клеток-хозяев12. Идентификация EVs как вторичные посыльных опухолевых клеток может быть полезна в неинвазивном выявлении тяжести заболевания.
miR-1246 высоко upregulated в EVs от агрессивного PCa, и это указывает на тяжесть заболевания13. Эти связанные с EV миРНК не только служат неинвазивными биомаркерами заболевания, но и играют функционально важную роль в продвижении опухолевого интогенеза. Таким образом, важно понять значение репертуара miRNA, который связан с устойчивыми формами PCa, чтобы лучше идентифицировать неинвазивные биомаркеры, а также их функциональное значение.
Появление следующего поколения секвенирования предложил наиболее полную платформу для изучения деталей опухолевого ландшафта с участием изменений в геноме, таких как мутации, хромосомные переселения, хромотрипс, и метилирование, все из которых вносят значительный вклад в форму и природу рака14,15,16. Кроме того, это также важный инструмент, чтобы понять огромные эпигеномные изменения, которые происходят в опухолевой клетке и которые часто являются важными игроками в тяжести заболевания17. С целью понимания репертуара miRNA, связанного с генерацией NEPC, небольшое секвенирование РНК было выполнено на метастатических тканях FFPE CRPC и их соответствующих EVs, полученных в сыворотке. РНК, полученная из любого из этих двух источников выборки (1) с низким уровнем урожайности и (2) плохого качества из-за деградации, которая часто происходит из-за фиксации формалина и изоляции EV. Кроме того, создание библиотек кДНК является критическим, но громоздким шагом последовательности. Таким образом, методы изоляции этих РНК и их использования для генерации библиотек для мелкого секвенирования РНК требуют оптимизации для генерации точных и надежных данных.
Существует несколько методов профилирования экспрессии miRNA в различных образцах, включая RT-PCR, microarrays и гибридизацию на месте (ISH). Протокол с использованием FFPE ткани полученных РНК для оценки экспрессии miRNA по RT-PCR и ISH был недавно опубликован18. Более поздние технологии предлагают более исчерпывающие и всеобъемлющие платформы для профилирования выражения miRNA в выборке. NanoString nCounter предлагает чувствительную платформу обнаружения miRNA19, но обнаружение часто ограничивается количеством miRNAs, которые доступны в массиве (2000 евро). В таком сценарии более чувствительная и исчерпывающая платформа, такая как секвенирование следующего поколения, предлагает гораздо более широкую глубину идентификации miRNA и одновременного профилирования в различных образцах20. Метод был использован для определения сигнатур miRNA в моче или плазме от пациентов PCa21,22,23. В текущей статье представлен протокол для использования платформы секвенирования следующего поколения для изучения профилей miRNA, связанных с агрессивными CRPC с использованием тканей FFPE и сывороточных EV РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описываем протокол для изоляции РНК от тканей FFPE и EVs, полученных из сыворотки, с использованием комплектов, которые были оптимизированы для повышения урожайности и качества изолированных РНК. Кроме того, очищенные РНК использовались для генерации библиотек кДНК для се…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается армии США медицинских исследований Приобретение деятельности (USAMRAA) через Idea Development Award underAward No. W81XWH-18-1-303 и W81XWH-18-2-0013 и дополнительно Премии Нет. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, и W81XWH-18-2-0019 Рак предстательной железы Биопозиторий сети (PCBN). Подтверждена также поддержка авторской лаборатории Национальным институтом рака при Национальных институтах здравоохранения (Grant Number RO1CA177984). Раджвир Дахия (Rajvir Dahiya) является старшим научным сотрудником Департамента по делам ветеранов, BX004473 и финансируется NIH-UO1CA199694 (RD). Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены Министерством обороны или армией США. Мы благодарны Джуди Шигенага, директору основного объекта в Сан-Франциско VAMC, за ее помощь с nextSeq 500 секвенсор.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
