In vivo muismodel van spinale implantaatinfectie

Summary

Het protocol beschrijft een nieuw in vivo muismodel van spinale implantaatinfectie waarbij een roestvrijstalen k-draadimplantaat is geïnfecteerd met bioluminescente Staphylococcus aureus Xen36. De bacteriële belasting wordt longitudinaal gemonitord met bioluminescente beeldvorming en bevestigd met kolonievormende eenheidstellingen na euthanasie.

Abstract

Infecties van wervelkolomimplantaten voorspellen slechte resultaten, aangezien de diagnose een uitdaging is en chirurgische uitroeiing op gespannen voet staat met de mechanische stabiliteit van de wervelkolom. Het doel van deze methode is het beschrijven van een nieuw muismodel van spinale implantaatinfectie (SII) dat is gemaakt om een goedkoop, snel en nauwkeurig in vivo hulpmiddel te bieden om potentiële therapieën en behandelingsstrategieën voor spinale implantaatinfecties te testen.

In deze methode presenteren we een model van spinale chirurgie in de posterieure benadering waarbij een roestvrijstalen k-draad wordt gefixeerd in het L4-processus spinosus van 12 weken oude C57BL/6J wildtype muizen en wordt geïnoculeerd met 1 x 10³ CFU van een bioluminescente stam van Staphylococcus aureus Xen36-bacteriën. Muizen worden vervolgens longitudinaal in beeld gebracht voor bioluminescentie in vivo op postoperatieve dagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 en 35. Bioluminescentiebeeldvorming (BLI)-signalen uit een gestandaardiseerd gezichtsveld worden gekwantificeerd om in vivo de bacteriële belasting te meten.

Om bacteriën te kwantificeren die zich hechten aan implantaten en peri-implantair weefsel, worden muizen geëuthanaseerd en worden het implantaat en het omliggende zachte weefsel geoogst. Bacteriën worden losgemaakt van het implantaat door middel van sonicatie, ‘s nachts gekweekt en vervolgens worden kolonievormende eenheden (CFU’s) geteld. De resultaten van deze methode omvatten longitudinale bacterietellingen zoals gemeten door in vivo S. aureus-bioluminescentie (gemiddelde maximale flux) en CFU-tellingen na euthanasie.

Terwijl eerdere diermodellen van geïnstrumenteerde wervelkolominfectie invasieve, ex vivo weefselanalyse hebben omvat, maakt het muismodel van SII dat in dit artikel wordt gepresenteerd, gebruik van niet-invasieve, real-time in vivo optische beeldvorming van bioluminescente bacteriën om statisch weefselonderzoek te vervangen. Toepassingen van het model zijn breed en kunnen bestaan uit het gebruik van alternatieve bioluminescente bacteriestammen, het opnemen van andere soorten genetisch gemanipuleerde muizen om tegelijkertijd de immuunrespons van de gastheer te bestuderen, en het evalueren van huidige of het onderzoeken van nieuwe diagnostische en therapeutische modaliteiten zoals antibiotica of implantaatcoatings.

Introduction

Het doel van deze methode is om een nieuw muismodel van spinale implantaatinfectie (SII) te beschrijven. Dit model is ontworpen om een goedkoop en nauwkeurig hulpmiddel te bieden om het effect van gastheer-, pathogeen- en/of implantaatvariabelen in vivo flexibel te beoordelen. Het testen van potentiële therapieën en behandelingsstrategieën voor spinale implantaatinfecties in dit model is gericht op het begeleiden van onderzoeksontwikkeling voorafgaand aan toepassing in grotere diermodellen en klinische proeven.

Implantaatgerelateerde infectie na een wervelkolomoperatie is een verwoestende complicatie en komt helaas voor bij ongeveer 3-8% van de patiënten die een electieve wervelkolomoperatie ondergaan 1,2,3,4,5 en tot 65% van de patiënten die een multilevel- of revisieoperatie ondergaan ⁶. Behandeling van spinale implantaatinfecties vereist vaak meerdere ziekenhuisopnames, meerdere operaties en langdurige antibioticatherapie. SII’s voorspellen slechte resultaten voor de patiënt, waaronder neurologische compromittering, invaliditeit en een verhoogd risico op sterfte. Het beheer van SII is extreem duur en kost meer dan $ 900,000 per patiënt⁷.

Staphylococcus aureus is de meest voorkomende virulente ziekteverwekker van SII 8,9,10,11. Bacteriën kunnen de hardware direct tijdens de operatie zaaien, via de wond tijdens de postoperatieve periode of later via hematogene verspreiding. In aanwezigheid van metalen implantaten vormt S. aureus een biofilm die de bacteriën beschermt tegen antibioticatherapie en immuuncellen. Hoewel het verwijderen van geïnfecteerde hardware kan helpen om een infectie effectief uit te roeien, is dit vaak niet haalbaar in de wervelkolom zonder destabilisatie te veroorzaken en neurologische compromittering te riskeren¹².

Bij gebrek aan explantatie van geïnfecteerde hardware zijn nieuwe benaderingen nodig om SII te voorkomen, op te sporen en te behandelen. Historisch gezien zijn er beperkte diermodellen van SII om de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe therapieën efficiënt te beoordelen. Eerdere diermodellen van SII vereisen grote aantallen dieren en het verzamelen van datapunten die euthanasie vereisen, waaronder het tellen van kolonies, histologie en cultuur^13,14,15. Bij gebrek aan longitudinale in vivo monitoring bieden deze modellen slechts één datapunt per dier en zijn daarom duur en inefficiënt.

Eerder werk dat een muismodel van knieartroplastiekinfectie bestudeerde, stelde de waarde en nauwkeurigheid vast van niet-invasieve in vivo optische beeldvorming om de infectielast longitudinaal te bewaken¹⁶. De detectie van bioluminescentie maakt het mogelijk om de bacteriële belasting over een longitudinaal tijdsverloop in een enkel dier humaan, nauwkeurig en efficiënt te kwantificeren. Bovendien hebben eerdere studies een hoge correlatie aangetoond tussen in vivo bioluminescentie en CFU’s die aan implantaten hechten¹⁷. Het vermogen om infecties in de loop van de tijd te volgen, heeft geleid tot een meer genuanceerd begrip van implantaatgerelateerde infecties. Bovendien heeft het op deze manier monitoren van longitudinale infecties het mogelijk gemaakt om de effectiviteit van antibioticatherapie en nieuwe antimicrobiële stoffen nauwkeurig te beoordelen^16,17,18.

Met behulp van deze hulpmiddelen hebben we een model van postoperatieve spinale implantaatinfectie ontwikkeld en gevalideerd. In de gepresenteerde methode gebruiken we een inoculum van bioluminescente S. aureus Xen36 om een in vivo muismodel van SII op te stellen om de bacteriële belasting longitudinaal te monitoren^16,17,18. Dit nieuwe model biedt een waardevol hulpmiddel om potentiële detectie-, preventie- en behandelingsstrategieën voor SII efficiënt te testen voordat ze worden toegepast in grotere diermodellen en klinische onderzoeken.

Protocol

Alle dieren werden behandeld in strikte overeenstemming met goede dierpraktijken zoals gedefinieerd in de federale regelgeving zoals uiteengezet in de Animal Welfare Act (AWA), de 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, PHS Policy for the Humane Care and Use of Laboratory Animals, evenals het beleid en de procedures van de instelling zoals uiteengezet in de Animal Care and Use Training Manual, en al het dierenwerk werd goedgekeurd door de University of California Los Angeles Chancellor’s Animal Research C…

Representative Results

De hier gepresenteerde procedure werd gebruikt om de werkzaamheid van antibioticaregimes te beoordelen in een in vivo muismodel van SII. In het bijzonder werd de werkzaamheid van combinatietherapie met vancomycine- en rifampicine-antibiotica vergeleken met monotherapie met vancomycine en onbehandelde geïnfecteerde controles. Voorafgaand aan de operatie werden muizen gerandomiseerd naar combinatietherapie, monotherapie of geïnfecteerde controle. Er werd een statistische poweranalyse uitgevoer…

Discussion

Implantaatgerelateerde infecties in de wervelkolom voorspellen slechte resultaten voor patiënten 1,2,3,4,5. In tegenstelling tot veel andere delen van het lichaam, kan geïnfecteerde hardware in de wervelkolom vaak niet worden verwijderd vanwege het risico op instabiliteit en neurologische compromittering. Deze unieke uitdaging in de setting van biofilmbacter…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP