Modelo de ratón in vivo de infección por implante espinal

Summary

El protocolo describe un nuevo modelo de ratón in vivo de infección por implante espinal en el que un implante de alambre k de acero inoxidable está infectado con Staphylococcus aureus Xen36 bioluminiscente. La carga bacteriana se monitoriza longitudinalmente con imágenes bioluminiscentes y se confirma con recuentos de unidades formadoras de colonias después de la eutanasia.

Abstract

Las infecciones de los implantes de columna vertebral presagian malos resultados, ya que el diagnóstico es difícil y la erradicación quirúrgica está en desacuerdo con la estabilidad mecánica de la columna. El propósito de este método es describir un nuevo modelo de ratón de infección por implante espinal (SII) que se creó para proporcionar una herramienta in vivo económica, rápida y precisa para probar posibles terapias y estrategias de tratamiento para las infecciones de implantes espinales.

En este método, presentamos un modelo de cirugía espinal de abordaje posterior en el que se transfija un alambre k de acero inoxidable en la apófisis espinosa L4 de ratones de tipo salvaje C57BL/6J de 12 semanas de edad y se inocula con 1 x 10³ UFC de una cepa bioluminiscente de la bacteria Staphylococcus aureus Xen36. A continuación, se obtienen imágenes longitudinales de la bioluminiscencia de los ratones in vivo en los días postoperatorios 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 y 35. Las señales de imágenes de bioluminiscencia (BLI) de un campo de visión estandarizado se cuantifican para medir la carga bacteriana in vivo.

Para cuantificar las bacterias que se adhieren a los implantes y al tejido periimplantario, se sacrifica a los ratones y se extrae el implante y el tejido blando circundante. Las bacterias se desprenden del implante mediante sonicación, se cultivan durante la noche y luego se cuentan las unidades formadoras de colonias (UFC). Los resultados obtenidos de este método incluyen recuentos bacterianos longitudinales medidos por bioluminiscencia in vivo de S. aureus (flujo máximo medio) y recuentos de UFC después de la eutanasia.

Si bien los modelos animales anteriores de infección instrumentada de la columna vertebral han implicado un análisis invasivo de tejido ex vivo, el modelo de ratón de SII presentado en este artículo aprovecha las imágenes ópticas in vivo no invasivas y en tiempo real de bacterias bioluminiscentes para reemplazar el estudio de tejido estático. Las aplicaciones del modelo son amplias y pueden incluir la utilización de cepas bacterianas bioluminiscentes alternativas, la incorporación de otros tipos de ratones modificados genéticamente para estudiar simultáneamente la respuesta inmunitaria del huésped y la evaluación de las modalidades diagnósticas y terapéuticas actuales o la investigación de nuevas modalidades, como antibióticos o recubrimientos de implantes.

Introduction

El propósito de este método es describir un nuevo modelo murino de infección por implante espinal (SII). Este modelo fue diseñado para proporcionar una herramienta económica y precisa para evaluar de manera flexible el efecto de las variables del huésped, el patógeno y/o el implante in vivo. La prueba de posibles terapias y estrategias de tratamiento para las infecciones de implantes espinales en este modelo tiene como objetivo guiar el desarrollo de la investigación antes de su aplicación en modelos animales más grandes y ensayos clínicos.

La infección relacionada con los implantes después de la cirugía de columna vertebral es una complicación devastadora y, por desgracia, ocurre en aproximadamente el 3-8% de los pacientes que se someten a cirugía electiva de columna^vertebral 1,2,3,4,5 y hasta el 65% de los pacientes que se someten a cirugía multinivel o de revisión 6. El tratamiento de las infecciones de los implantes espinales a menudo requiere múltiples hospitalizaciones, múltiples cirugías y terapia antibiótica prolongada. Los SII presagian malos resultados para los pacientes, como el compromiso neurológico, la discapacidad y un mayor riesgo de mortalidad. El manejo del SII es extremadamente costoso, con un costo de más de $900,000 por paciente⁷.

Staphylococcus aureus es el patógeno virulento más común del SII 8,9,10,11. Las bacterias pueden sembrar el hardware directamente durante la cirugía, a través de la herida durante el período postoperatorio o más tarde a través de la diseminación hematógena. En presencia de implantes metálicos, S. aureus forma una biopelícula que protege a las bacterias de la terapia antibiótica y de las células inmunitarias. Si bien la eliminación del hardware infectado puede ayudar a erradicar eficazmente una infección, esto con frecuencia no es factible en la columna vertebral sin causar desestabilización y riesgo de compromiso neurológico¹².

En ausencia de la explantación de hardware infectado, se necesitan enfoques novedosos para prevenir, detectar y tratar el SII. Históricamente, ha habido modelos animales limitados de SII para evaluar de manera eficiente la seguridad y eficacia de las nuevas terapias. Los modelos animales anteriores de SII requieren un gran número de animales y la recolección de puntos de datos que requieren eutanasia, incluido el recuento de colonias, la histología y el cultivo^13,14,15. Al carecer de un seguimiento longitudinal in vivo, estos modelos solo proporcionan un punto de datos por animal y, por lo tanto, son caros e ineficientes.

Trabajos anteriores que estudiaron un modelo de ratón de infección por artroplastia de rodilla establecieron el valor y la precisión de las imágenes ópticas in vivo no invasivas para monitorizar longitudinalmente la carga de infección¹⁶. La detección de la bioluminiscencia permite cuantificar la carga bacteriana a lo largo de un curso de tiempo longitudinal en un solo animal de forma humana, precisa y eficiente. Además, estudios previos han demostrado una alta correlación entre la bioluminiscencia in vivo y las UFC adheridas a implantes¹⁷. La capacidad de rastrear la infección a lo largo del tiempo ha llevado a una comprensión más matizada de la infección relacionada con los implantes. Además, el monitoreo de la infección longitudinal de esta manera, ha permitido evaluar con precisión la efectividad de la terapia antibiótica y de los nuevos antimicrobianos^16,17,18.

Aprovechando estas herramientas, desarrollamos y validamos un modelo de infección postoperatoria de implantes espinales. En el método presentado, utilizamos un inóculo de S. aureus Xen36 bioluminiscente para establecer un modelo murino in vivo de SII para monitorear longitudinalmente la carga bacteriana^16,17,18. Este novedoso modelo proporciona una herramienta valiosa para probar de manera eficiente las posibles estrategias de detección, prevención y tratamiento del SII antes de su aplicación en modelos animales más grandes y ensayos clínicos.

Protocol

Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con las buenas prácticas animales según se define en las regulaciones federales según lo establecido en la Ley de Bienestar Animal (AWA), la Guía de 1996 para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Política de PHS para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio, así como las políticas y procedimientos de la institución según lo establecido en el Manual de Capacitación para el Cuidado y Uso de Animales. y todo el trabajo con anima…

Representative Results

El procedimiento que aquí se presenta se utilizó para evaluar la eficacia de los regímenes antibióticos en un modelo de SII en ratones in vivo. Específicamente, se comparó la eficacia de la terapia combinada con antibióticos con vancomicina y rifampicina con la monoterapia con vancomicina y los controles infectados no tratados. Antes de la cirugía, los ratones fueron aleatorizados a terapia combinada, monoterapia o control infectado. Se realizó un análisis estadístico de potencia pa…

Discussion

Las infecciones relacionadas con implantes en la columna vertebral presagian malos resultados para los pacientes 1,2,3,4,5. A diferencia de muchas otras áreas del cuerpo, el hardware infectado en la columna vertebral con frecuencia no se puede eliminar debido al riesgo de inestabilidad y compromiso neurológico. Este desafío único en el entorno de bacterias…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP